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shourjruo

铜虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】重叠PCR问题

将500bp的片段与4000bp的片段进行连接的重叠PCR实验。中间引物设计没有问题，单独两片段PCR没有问题，并使用高保真不加A的taq酶，然后将两片段混合后在不加引物的情况下（其他按正常PCR体系添加）进行10轮PCR（40度退火），取这次PCR样品为模板进行正常PCR扩增，但总是得不到目的片段。
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1楼2011-01-13 09:34:21
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fungixx

至尊木虫 (文坛精英)
★ ★
最爱花诗雨(金币+2):鼓励交流 2011-01-13 15:50:34
shourjruo(金币+1): 2011-01-14 19:38:35
不知道你得配对区总共有多长，至少要保证20bp吧，是不是你得配不上啊。。。
感觉你不加引物的那次pcr是多余的，直接两个片段和上下游引物pcr就没问题
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2楼2011-01-13 15:48:49
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月月大可

木虫 (著名写手)
★ ★
rainwander(金币+2):鼓励积极参与交流~~~ 2011-01-13 17:36:30
shourjruo(金币+1): 2011-01-14 19:39:00
不用等10轮后再加引物了，直接加入全长的上下游引物，一下扩三十个循环。或者大量扩增两个片段，回收后直接混合，加入pcr反应体系后扩20个循环。

不管哪种建议反应结束后再使用可以加A的聚合酶处理，使外端加入A，链接T载体，使用菌落pcr大量筛选克隆。
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3楼2011-01-13 16:27:33
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shourjruo

铜虫 (小有名气)
谢谢！重叠区域有40bp
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4楼2011-01-14 19:42:53
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shourjruo

铜虫 (小有名气)
谢谢！重叠区域有40bp，尝试过直接加引物的方法，也没有目的条带。
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5楼2011-01-14 19:44:58
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gongeleven

铁杆木虫 (正式写手)
shourjruo(金币+1): 2011-01-15 13:40:34
shourjruo(金币+1): 2011-04-26 11:02:19
注意两片段最好胶回收，而且比例1:1
难道overlap区正反向不对……
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6楼2011-01-15 01:54:56
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魑魅-魍魉

新虫 (正式写手)
shourjruo(金币+1): 2011-01-15 13:40:39
shourjruo(金币+1): 2011-04-26 11:02:28
重叠区40BP你四十退火？ 温度低了吧
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7楼2011-01-15 12:10:56
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shourjruo

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 魑魅-魍魉 at 2011-01-15 12:10:56:
重叠区40BP你四十退火？ 温度低了吧

50度也试过的。
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8楼2011-01-15 13:41:18
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shourjruo

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by gongeleven at 2011-01-15 01:54:56:
注意两片段最好胶回收，而且比例1:1
难道overlap区正反向不对……

片段是回收的，重叠区应该没问题。
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9楼2011-01-15 13:42:12
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魑魅-魍魉

新虫 (正式写手)
shourjruo(金币+1): 2011-01-16 10:10:37
shourjruo(金币+1): 2011-04-26 11:02:38
引用回帖:
Originally posted by shourjruo at 2011-01-15 13:41:18:


50度也试过的。

我当时有23个重叠，58退火，你再试试，少弄几个循环，太多循环也不容易出来
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10楼2011-01-15 18:31:25
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shourjruo

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 魑魅-魍魉 at 2011-01-15 18:31:25:

我当时有23个重叠，58退火，你再试试，少弄几个循环，太多循环也不容易出来

好的，谢谢！
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11楼2011-01-16 10:11:02
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qurande

金虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
怎么样，做成功了么，我也要做这个了
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12楼2011-08-08 16:04:19
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匿名

用户注销 (著名写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
本帖仅楼主可见
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13楼2014-07-25 11:02:01
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