应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

Znn3bq.jpeg
小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】重叠PCR问题
131/1返回列表
查看: 2052  |  回复: 12
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

shourjruo

铜虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】重叠PCR问题

将500bp的片段与4000bp的片段进行连接的重叠PCR实验。中间引物设计没有问题，单独两片段PCR没有问题，并使用高保真不加A的taq酶，然后将两片段混合后在不加引物的情况下（其他按正常PCR体系添加）进行10轮PCR（40度退火），取这次PCR样品为模板进行正常PCR扩增，但总是得不到目的片段。
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:

» 抢金币啦！回帖就可以得到:

查看全部散金贴
1楼 2011-01-13 09:34:21
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

fungixx

至尊木虫 (文坛精英)
★ ★
最爱花诗雨(金币+2):鼓励交流 2011-01-13 15:50:34
shourjruo(金币+1): 2011-01-14 19:38:35
不知道你得配对区总共有多长，至少要保证20bp吧，是不是你得配不上啊。。。
感觉你不加引物的那次pcr是多余的，直接两个片段和上下游引物pcr就没问题
赞一下(1人) 回复此楼
2楼2011-01-13 15:48:49
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

月月大可

木虫 (著名写手)
★ ★
rainwander(金币+2):鼓励积极参与交流~~~ 2011-01-13 17:36:30
shourjruo(金币+1): 2011-01-14 19:39:00
不用等10轮后再加引物了，直接加入全长的上下游引物，一下扩三十个循环。或者大量扩增两个片段，回收后直接混合，加入pcr反应体系后扩20个循环。

不管哪种建议反应结束后再使用可以加A的聚合酶处理，使外端加入A，链接T载体，使用菌落pcr大量筛选克隆。
赞一下(1人) 回复此楼
3楼2011-01-13 16:27:33
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

shourjruo

铜虫 (小有名气)
谢谢！重叠区域有40bp
赞一下 回复此楼
4楼2011-01-14 19:42:53
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

shourjruo

铜虫 (小有名气)
谢谢！重叠区域有40bp，尝试过直接加引物的方法，也没有目的条带。
赞一下 回复此楼
5楼2011-01-14 19:44:58
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

gongeleven

铁杆木虫 (正式写手)
shourjruo(金币+1): 2011-01-15 13:40:34
shourjruo(金币+1): 2011-04-26 11:02:19
注意两片段最好胶回收，而且比例1:1
难道overlap区正反向不对……
赞一下 回复此楼
6楼2011-01-15 01:54:56
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

魑魅-魍魉

新虫 (正式写手)
shourjruo(金币+1): 2011-01-15 13:40:39
shourjruo(金币+1): 2011-04-26 11:02:28
重叠区40BP你四十退火？ 温度低了吧
赞一下 回复此楼
7楼2011-01-15 12:10:56
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

shourjruo

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 魑魅-魍魉 at 2011-01-15 12:10:56:
重叠区40BP你四十退火？ 温度低了吧

50度也试过的。
回复此楼
8楼2011-01-15 13:41:18
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

shourjruo

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by gongeleven at 2011-01-15 01:54:56:
注意两片段最好胶回收，而且比例1:1
难道overlap区正反向不对……

片段是回收的，重叠区应该没问题。
赞一下 回复此楼
9楼2011-01-15 13:42:12
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

魑魅-魍魉

新虫 (正式写手)
shourjruo(金币+1): 2011-01-16 10:10:37
shourjruo(金币+1): 2011-04-26 11:02:38
引用回帖:
Originally posted by shourjruo at 2011-01-15 13:41:18:


50度也试过的。

我当时有23个重叠，58退火，你再试试，少弄几个循环，太多循环也不容易出来
赞一下 回复此楼
10楼2011-01-15 18:31:25
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

shourjruo

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 魑魅-魍魉 at 2011-01-15 18:31:25:

我当时有23个重叠，58退火，你再试试，少弄几个循环，太多循环也不容易出来

好的，谢谢！
回复此楼
11楼2011-01-16 10:11:02
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

qurande

金虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
怎么样，做成功了么，我也要做这个了
赞一下(1人) 回复此楼
12楼2011-08-08 16:04:19
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

匿名

用户注销 (著名写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
本帖仅楼主可见
赞一下
13楼2014-07-25 11:02:01
已阅   申请MolEPI   回复此楼   编辑   查看我的主页
相关版块跳转 我要订阅楼主 shourjruo 的主题更新
131/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 297求调剂 +13 ORCHID1 2026-04-10 14/700 2026-04-11 11:36 by flapl
[考研] 调剂 +9 只叙离别辞 2026-04-09 11/550 2026-04-11 10:42 by zhq0425
[考研] 268分085602化学工程调剂 +27 月照花林。 2026-04-09 27/1350 2026-04-11 10:40 by maddjdld
[考研] 085500求调剂材料 +10 易11122 2026-04-09 10/500 2026-04-11 10:39 by maddjdld
[考研] 0854求调剂 +7 assdll 2026-04-05 7/350 2026-04-11 10:34 by Delta2012
[考研] 282，求调剂 +12 jggshjkkm 2026-04-09 14/700 2026-04-11 09:39 by 猪会飞
[考研] 281求调剂 +11 觉得好的吧 2026-04-10 11/550 2026-04-11 09:35 by 逆水乘风
[考研] 调剂 +19 小张ZA 2026-04-10 20/1000 2026-04-10 22:08 by 猪会飞
[考研] 青岛科技大学材料学院，环境学院调剂补录4月10日以前都可以 +3 1青科大。 2026-04-09 5/250 2026-04-10 09:58 by 翩翩一书生
[考研] 材料307分求大佬组收留 +17 Hll胡 2026-04-07 17/850 2026-04-09 10:53 by liuhuiying09
[考研] 085404，334分，求调剂 +5 sunjie8888 2026-04-08 8/400 2026-04-09 07:26 by sunjie8888
[考研] 电子信息346 +4 zuoshaodian 2026-04-08 4/200 2026-04-08 11:54 by zzucheup
[考研] 22408 266求调剂 +11 masss11222 2026-04-07 14/700 2026-04-08 11:06 by yulian1987
[考研] 277、学硕，求调剂 数一104， +11 瓶子PZ 2026-04-07 12/600 2026-04-07 23:30 by 一只好果子?
[考研] 材料调剂 +11 一样YWY 2026-04-07 11/550 2026-04-07 15:13 by shdgaomin
[考研] 328求调剂 +4 ghhh88888 2026-04-06 5/250 2026-04-07 14:45 by ghhh88888
[考研] 316求调剂 +7 yyx想调剂 2026-04-05 7/350 2026-04-07 14:31 by shdgaomin
[考研] 307求调剂 +3 所念及所望 2026-04-06 3/150 2026-04-06 17:30 by 土木硕士招生
[考研] 求调剂 +7 张.1 2026-04-05 7/350 2026-04-05 20:40 by 啵啵啵0119
[考研] 296求调剂 +3 汪！？！ 2026-04-05 4/200 2026-04-05 20:13 by 啵啵啵0119
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭