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shourjruo

铜虫 (小有名气)


[交流] 【求助/交流】重叠PCR问题

将500bp的片段与4000bp的片段进行连接的重叠PCR实验。中间引物设计没有问题,单独两片段PCR没有问题,并使用高保真不加A的taq酶,然后将两片段混合后在不加引物的情况下(其他按正常PCR体系添加)进行10轮PCR(40度退火),取这次PCR样品为模板进行正常PCR扩增,但总是得不到目的片段。
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魑魅-魍魉

新虫 (正式写手)


shourjruo(金币+1): 2011-01-16 10:10:37
shourjruo(金币+1): 2011-04-26 11:02:38
引用回帖:
Originally posted by shourjruo at 2011-01-15 13:41:18:


50度也试过的。

我当时有23个重叠,58退火,你再试试,少弄几个循环,太多循环也不容易出来
10楼2011-01-15 18:31:25
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fungixx

至尊木虫 (文坛精英)


★ ★
最爱花诗雨(金币+2):鼓励交流 2011-01-13 15:50:34
shourjruo(金币+1): 2011-01-14 19:38:35
不知道你得配对区总共有多长,至少要保证20bp吧,是不是你得配不上啊。。。
感觉你不加引物的那次pcr是多余的,直接两个片段和上下游引物pcr就没问题
2楼2011-01-13 15:48:49
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月月大可

木虫 (著名写手)


★ ★
rainwander(金币+2):鼓励积极参与交流~~~ 2011-01-13 17:36:30
shourjruo(金币+1): 2011-01-14 19:39:00
不用等10轮后再加引物了,直接加入全长的上下游引物,一下扩三十个循环。或者大量扩增两个片段,回收后直接混合,加入pcr反应体系后扩20个循环。

不管哪种建议反应结束后再使用可以加A的聚合酶处理,使外端加入A,链接T载体,使用菌落pcr大量筛选克隆。
3楼2011-01-13 16:27:33
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shourjruo

铜虫 (小有名气)


谢谢!重叠区域有40bp
4楼2011-01-14 19:42:53
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