应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】重叠PCR问题
51/1返回列表
查看: 2384  |  回复: 12
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

shourjruo

铜虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】重叠PCR问题

将500bp的片段与4000bp的片段进行连接的重叠PCR实验。中间引物设计没有问题，单独两片段PCR没有问题，并使用高保真不加A的taq酶，然后将两片段混合后在不加引物的情况下（其他按正常PCR体系添加）进行10轮PCR（40度退火），取这次PCR样品为模板进行正常PCR扩增，但总是得不到目的片段。
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:

» 抢金币啦！回帖就可以得到:

查看全部散金贴
1楼 2011-01-13 09:34:21
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

shourjruo

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 魑魅-魍魉 at 2011-01-15 18:31:25:

我当时有23个重叠，58退火，你再试试，少弄几个循环，太多循环也不容易出来

好的，谢谢！
回复此楼
11楼2011-01-16 10:11:02
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 13 个回答

fungixx

至尊木虫 (文坛精英)
★ ★
最爱花诗雨(金币+2):鼓励交流 2011-01-13 15:50:34
shourjruo(金币+1): 2011-01-14 19:38:35
不知道你得配对区总共有多长，至少要保证20bp吧，是不是你得配不上啊。。。
感觉你不加引物的那次pcr是多余的，直接两个片段和上下游引物pcr就没问题
赞一下(1人) 回复此楼
2楼2011-01-13 15:48:49
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

月月大可

木虫 (著名写手)
★ ★
rainwander(金币+2):鼓励积极参与交流~~~ 2011-01-13 17:36:30
shourjruo(金币+1): 2011-01-14 19:39:00
不用等10轮后再加引物了，直接加入全长的上下游引物，一下扩三十个循环。或者大量扩增两个片段，回收后直接混合，加入pcr反应体系后扩20个循环。

不管哪种建议反应结束后再使用可以加A的聚合酶处理，使外端加入A，链接T载体，使用菌落pcr大量筛选克隆。
赞一下(1人) 回复此楼
3楼2011-01-13 16:27:33
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

shourjruo

铜虫 (小有名气)
谢谢！重叠区域有40bp
赞一下 回复此楼
4楼2011-01-14 19:42:53
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 13 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[论文投稿] 售SCI一区文章，我:8O5.5.1.O5.4,科目全,可伽急 +3 2JOx3r2CYEgw 2026-08-22 4/200 2026-08-23 04:04 by OEbVnUOu01ol
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.5.4,科目全,可+急 +3 2JOx3r2CYEgw 2026-08-22 7/350 2026-08-23 03:55 by OEbVnUOu01ol
[论文投稿] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.5.4,科目全,可+急 +3 QTy3jDtz1uLt 2026-08-21 9/450 2026-08-23 03:04 by OEbVnUOu01ol
[考博] 售SCI文章，我:8O.5.5.1O.54,科目全,可十急 +3 DpSrDtM079iu 2026-08-22 3/150 2026-08-23 00:55 by OEbVnUOu01ol
[基金申请] 93BebMhtakh前后11位开头都是大写 +7 且听虎啸 2026-08-17 8/400 2026-08-22 21:55 by 医学老男孩
[基金申请] 只有每年这种时候来逛逛小木虫 +24 yaoyewhu2008 2026-08-20 26/1300 2026-08-22 17:43 by kammury
[基金申请] 时间戳今天，20号变了 +5 archvillain 2026-08-20 5/250 2026-08-22 06:12 by hui_daxiao
[基金申请] 建议基金发布提前给出明确的时间点 +10 kulium 2026-08-21 13/650 2026-08-21 21:58 by alongwaytogo
[基金申请] 今日不放榜？网传国自然预计 8 月 27 日可查结果 +16 医学老男孩 2026-08-20 20/1000 2026-08-21 21:13 by Ldrop2023
[基金申请] 看来今天不会放榜了？ +8 chengyan1220 2026-08-21 11/550 2026-08-21 17:52 by dcqxinyang
[基金申请] 时间戳又变了 +13 wuchongjun 2026-08-20 19/950 2026-08-21 17:21 by 紫杉醇
[基金申请] 让我中一个面上吧！ +11 大萍1987 2026-08-20 13/650 2026-08-21 14:48 by 20120902066
[基金申请] 感觉是下周放榜了 +7 angus9576 2026-08-17 12/600 2026-08-21 13:38 by weiyin
[基金申请] 我面上完蛋了 +7 且听虎啸 2026-08-20 8/400 2026-08-21 12:31 by 酷酷墨镜
[基金申请] 应该是下周三26日公布了吧？ +4 哈哈蛤？ 2026-08-21 4/200 2026-08-21 10:58 by Vivilian
[基金申请] 今天放榜没戏了吧 +9 yuleib84 2026-08-19 11/550 2026-08-21 10:06 by gltch
[基金申请] 基金啊基金 +4 longfie172 2026-08-20 4/200 2026-08-21 08:58 by mark mao
[基金申请] 时间戳变了，能看出什么问题？ +18 基诺咪客 2026-08-17 23/1150 2026-08-20 17:19 by Godzela
[基金申请] 重要消息，中午系统在维护 +11 yuleib84 2026-08-18 12/600 2026-08-20 11:09 by xskun
[基金申请] 朋友圈看到的 +6 wangzilk 2026-08-18 8/400 2026-08-19 10:55 by Haru815
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭