24小时热门版块排行榜    

查看: 1998  |  回复: 12
当前只显示满足指定条件的回帖,点击这里查看本话题的所有回帖

shourjruo

铜虫 (小有名气)


[交流] 【求助/交流】重叠PCR问题

将500bp的片段与4000bp的片段进行连接的重叠PCR实验。中间引物设计没有问题,单独两片段PCR没有问题,并使用高保真不加A的taq酶,然后将两片段混合后在不加引物的情况下(其他按正常PCR体系添加)进行10轮PCR(40度退火),取这次PCR样品为模板进行正常PCR扩增,但总是得不到目的片段。
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐,对您同样有帮助:

» 抢金币啦!回帖就可以得到:

查看全部散金贴

已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

shourjruo

铜虫 (小有名气)


引用回帖:
Originally posted by gongeleven at 2011-01-15 01:54:56:
注意两片段最好胶回收,而且比例1:1
难道overlap区正反向不对……

片段是回收的,重叠区应该没问题。
9楼2011-01-15 13:42:12
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 13 个回答

fungixx

至尊木虫 (文坛精英)


★ ★
最爱花诗雨(金币+2):鼓励交流 2011-01-13 15:50:34
shourjruo(金币+1): 2011-01-14 19:38:35
不知道你得配对区总共有多长,至少要保证20bp吧,是不是你得配不上啊。。。
感觉你不加引物的那次pcr是多余的,直接两个片段和上下游引物pcr就没问题
2楼2011-01-13 15:48:49
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

月月大可

木虫 (著名写手)


★ ★
rainwander(金币+2):鼓励积极参与交流~~~ 2011-01-13 17:36:30
shourjruo(金币+1): 2011-01-14 19:39:00
不用等10轮后再加引物了,直接加入全长的上下游引物,一下扩三十个循环。或者大量扩增两个片段,回收后直接混合,加入pcr反应体系后扩20个循环。

不管哪种建议反应结束后再使用可以加A的聚合酶处理,使外端加入A,链接T载体,使用菌落pcr大量筛选克隆。
3楼2011-01-13 16:27:33
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

shourjruo

铜虫 (小有名气)


谢谢!重叠区域有40bp
4楼2011-01-14 19:42:53
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通表情 高级回复 (可上传附件)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 课题组接收材料类调剂研究生 +4 gaoxiaoniuma 2026-02-28 6/300 2026-03-02 22:29 by gaoxiaoniuma
[考研] 材料化工调剂 +13 今夏不夏 2026-03-01 16/800 2026-03-02 22:11 by sunny81
[考研] 276求调剂 +5 路lyh123 2026-02-28 6/300 2026-03-02 20:35 by hypershenger
[考研] 求调剂 +7 repeatt?t 2026-02-28 7/350 2026-03-02 20:34 by hypershenger
[考研] 285求调剂 +9 满头大汗的学生 2026-02-28 9/450 2026-03-02 20:29 by hypershenger
[考研] 环境调剂 +4 chenhanheng 2026-03-02 4/200 2026-03-02 20:23 by hypershenger
[考研] 材料270求调剂 6+4 Eiiiio 2026-03-01 7/350 2026-03-02 20:17 by hypershenger
[考研] 271求调剂 +3 Ricardo1113 2026-03-02 3/150 2026-03-02 19:53 by zhukairuo
[考研] 290求调剂 +6 ErMiao1020 2026-03-02 6/300 2026-03-02 18:14 by lature00
[考研] 一志愿东北大学材料专硕328,求调剂 +3 shs1083 2026-03-02 3/150 2026-03-02 17:27 by houyaoxu
[考研] 292求调剂 +7 yhk_819 2026-02-28 7/350 2026-03-02 12:43 by 无际的草原
[考研] 295求调剂 +8 19171856320 2026-02-28 8/400 2026-03-02 11:19 by yuchj
[考研] 284求调剂 +10 天下熯 2026-02-28 11/550 2026-03-02 11:03 by 无际的草原
[硕博家园] 博士自荐 +7 科研狗111 2026-02-26 11/550 2026-03-01 22:24 by 哲平L
[考研] 化工299分求调剂 一志愿985落榜 +5 嘻嘻(*^ω^*) 2026-03-01 5/250 2026-03-01 19:47 by 无际的草原
[考研] 291分工科求调剂 +9 science饿饿 2026-03-01 10/500 2026-03-01 18:55 by 18137688336
[考研] 290求调剂 +9 材料专硕调剂; 2026-02-28 11/550 2026-03-01 17:21 by sunny81
[考研] 304求调剂 +6 曼殊2266 2026-02-28 7/350 2026-03-01 15:14 by wjLi2017
[考研] 调剂 +3 简木ChuFront 2026-02-28 3/150 2026-03-01 11:46 by 王伟要上岸啊
[考研] 317一志愿华南理工电气工程求调剂 +6 Soliloquy_Q 2026-02-28 11/550 2026-03-01 11:14 by 歌liekkas
信息提示
请填处理意见