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蓝慧

木虫 (正式写手)

[求助] 平末端连接不上,求助

大家好,本人最近在做平末端连接,我的PCR产物是混合引物PCR结果,用的是东洋纺的KOD-PLUS-NEO酶,PCR产物用OMEGA胶回收试剂盒进行回收,30微升体积稀释,回收后电泳检测有特异单一条带,浓度大约为150ng/ul,目的片段大小约为1500bp。接着进行连接,用的载体是全式金pEASY-blunt zero clonig KIT,连接体系5微升,包括2微升PCR产物,1微升载体,25度15min,之后50微升感受态转化,涂板,过夜培养,其中培养基为LB。培养后挑选白色菌落摇菌4小时M13引物菌液检测,可是PCR检测只有在100以下有个带,完全没有目的带,已经做了3次都是如此。现在都不知道是什么问题,请求各位虫子指点迷津,不胜感激!
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向着目标前进!
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zhaodahe

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
蓝慧: 金币+1 2012-12-19 19:32:25
具体说说你怎么PCR检测的呗?模板太多了不容易扩增。你可以把质粒快抽跑电泳,从大小就能看出来。
5楼2012-12-19 17:19:46
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
蓝慧: 金币+1, 有帮助 2012-12-19 15:54:41
PCR检测只有小于100的带是引物二聚体吧。你做PCR有做阳性对照吗?确定PCR条件合适?
2楼2012-12-19 12:10:01
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蓝慧

木虫 (正式写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-12-19 13:10:01
PCR检测只有小于100的带是引物二聚体吧。你做PCR有做阳性对照吗?确定PCR条件合适?

我用的是M13的通用引物,但是没有做过阳性对照,请教如何设计阳性对照?
向着目标前进!
3楼2012-12-19 12:32:31
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望海思月

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
蓝慧: 金币+1, 有帮助 2012-12-19 19:32:16
你的连接体系不对吧?平端连接,载体一点点就够了,片段要加大浓度
4楼2012-12-19 16:26:47
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