24小时热门版块排行榜    

CyRhmU.jpeg
查看: 2911  |  回复: 21

蓝慧

木虫 (正式写手)

引用回帖:
8楼: Originally posted by zhaodahe at 2012-12-19 21:41:43
我们都是菌落PCR,不会把培养基直接加到PCR体系中。质粒快抽也是用的固体平板上的菌苔或者离去上清的菌体,然后加各种溶液,跑电泳比较大小。...

谢谢,我试试
向着目标前进!
11楼2012-12-20 10:12:33
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zhangj0754

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
蓝慧: 金币+1, 有帮助 2012-12-20 16:45:44
我们也用全式金的,我一般用0.5的载体+1.5的片段(胶回收),50Trans1-T1感受态转化,2000以下的片段很好连的。不过我们之前PCR用的TAKARA的primestar酶。
12楼2012-12-20 10:36:42
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

aofeng860308

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
蓝慧: 金币+1, 有帮助 2012-12-20 16:45:50
没有用过你这个Kit,我就是做普通的平末端连接,体系是1uL载体,目的片段6uL,PEG1uL,buffer 1uL, ligase 1uL,4℃连接过夜,酶用的是fermentas的T4 DNA ligase。希望能给你参考。
13楼2012-12-20 10:42:47
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yanhua_2006

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
蓝慧: 金币+1, 有帮助 2012-12-20 16:46:22
你PCR产物切胶回收过程中用什么进行洗脱的?胶回收试剂盒应该有个漂洗液,然后晾干进行洗脱。注意漂洗液洗完之后一定要晾干,否则残留的乙醇会影响后续的连接实验。另外,连接尽量按照全式金载体使用说明书来进行连接,我认为你的转化应该是没有问题的,主要的问题可能出现在连接上。试试将回收产物完全晾干,或者用无菌超纯水进行洗脱。
14楼2012-12-20 11:04:18
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

蓝慧

木虫 (正式写手)

引用回帖:
14楼: Originally posted by yanhua_2006 at 2012-12-20 12:04:18
你PCR产物切胶回收过程中用什么进行洗脱的?胶回收试剂盒应该有个漂洗液,然后晾干进行洗脱。注意漂洗液洗完之后一定要晾干,否则残留的乙醇会影响后续的连接实验。另外,连接尽量按照全式金载体使用说明书来进行连 ...

胶回收的是用OMEGA的试剂盒,在漂洗后,有2分钟13000的空甩,应该是可以晾干的,溶解是用其溶解液进行溶解的。
向着目标前进!
15楼2012-12-20 16:48:29
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

蓝慧

木虫 (正式写手)

引用回帖:
13楼: Originally posted by aofeng860308 at 2012-12-20 11:42:47
没有用过你这个Kit,我就是做普通的平末端连接,体系是1uL载体,目的片段6uL,PEG1uL,buffer 1uL, ligase 1uL,4℃连接过夜,酶用的是fermentas的T4 DNA ligase。希望能给你参考。

谢谢意见!
向着目标前进!
16楼2012-12-20 16:48:44
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

ytetyio09

新虫 (正式写手)

可以试试这篇论文的方法,虽然是个小的改进,但是值得一试,而且很方便:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24613256
17楼2014-03-25 19:01:13
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

biostar2009

专家顾问 (正式写手)

实话实说,你用的那个连接kit我觉得相当不好用
如果你不愿意换公司
我试过,你就用pcDNA3,用EcoRV切开了,脱磷
就按照平末端普通连接体系做,都比那个kit效果好。
你可以用T7-F和SP6-F检测,空载应该有100bp多
因为你这个可以自己控制脱磷,自己控制空载自连的效率,比那个满天都是自连的好很多
或者,反正你都已经纯化了目的条带了,你也可以平末端产物Taq加A之后,换一个好一点的kit做AT克隆
18楼2014-03-25 19:49:33
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

hmily890404

新虫 (小有名气)

引用回帖:
12楼: Originally posted by zhangj0754 at 2012-12-20 10:36:42
我们也用全式金的,我一般用0.5的载体+1.5的片段(胶回收),50Trans1-T1感受态转化,2000以下的片段很好连的。不过我们之前PCR用的TAKARA的primestar酶。

最近也在连pEASY-BLunt, 都连不上,请问胶回收浓度50左右可以连么?片段2000,用的primestar
19楼2015-03-25 15:36:18
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

小尼姑shaki

禁虫 (小有名气)

本帖内容被屏蔽

20楼2018-09-11 16:48:55
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 zenghuilan 的主题更新
信息提示
请填处理意见