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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 平末端连接不上，求助
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蓝慧

木虫 (正式写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by zhaodahe at 2012-12-19 21:41:43
我们都是菌落PCR，不会把培养基直接加到PCR体系中。质粒快抽也是用的固体平板上的菌苔或者离去上清的菌体，然后加各种溶液，跑电泳比较大小。...

谢谢，我试试
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11楼2012-12-20 10:12:33
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zhangj0754

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
蓝慧: 金币+1, ★有帮助 2012-12-20 16:45:44
我们也用全式金的，我一般用0.5的载体+1.5的片段（胶回收），50Trans1-T1感受态转化，2000以下的片段很好连的。不过我们之前PCR用的TAKARA的primestar酶。
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12楼2012-12-20 10:36:42
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aofeng860308

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
蓝慧: 金币+1, ★有帮助 2012-12-20 16:45:50
没有用过你这个Kit，我就是做普通的平末端连接，体系是1uL载体，目的片段6uL，PEG1uL，buffer 1uL， ligase 1uL，4℃连接过夜，酶用的是fermentas的T4 DNA ligase。希望能给你参考。
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13楼2012-12-20 10:42:47
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yanhua_2006

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
蓝慧: 金币+1, ★有帮助 2012-12-20 16:46:22
你PCR产物切胶回收过程中用什么进行洗脱的？胶回收试剂盒应该有个漂洗液，然后晾干进行洗脱。注意漂洗液洗完之后一定要晾干，否则残留的乙醇会影响后续的连接实验。另外，连接尽量按照全式金载体使用说明书来进行连接，我认为你的转化应该是没有问题的，主要的问题可能出现在连接上。试试将回收产物完全晾干，或者用无菌超纯水进行洗脱。
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14楼2012-12-20 11:04:18
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蓝慧

木虫 (正式写手)
引用回帖:
14楼: Originally posted by yanhua_2006 at 2012-12-20 12:04:18
你PCR产物切胶回收过程中用什么进行洗脱的？胶回收试剂盒应该有个漂洗液，然后晾干进行洗脱。注意漂洗液洗完之后一定要晾干，否则残留的乙醇会影响后续的连接实验。另外，连接尽量按照全式金载体使用说明书来进行连 ...

胶回收的是用OMEGA的试剂盒，在漂洗后，有2分钟13000的空甩，应该是可以晾干的，溶解是用其溶解液进行溶解的。
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15楼2012-12-20 16:48:29
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蓝慧

木虫 (正式写手)
引用回帖:
13楼: Originally posted by aofeng860308 at 2012-12-20 11:42:47
没有用过你这个Kit，我就是做普通的平末端连接，体系是1uL载体，目的片段6uL，PEG1uL，buffer 1uL， ligase 1uL，4℃连接过夜，酶用的是fermentas的T4 DNA ligase。希望能给你参考。

谢谢意见！
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16楼2012-12-20 16:48:44
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ytetyio09

新虫 (正式写手)
可以试试这篇论文的方法，虽然是个小的改进，但是值得一试，而且很方便：
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24613256
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17楼2014-03-25 19:01:13
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biostar2009

专家顾问 (正式写手)
实话实说，你用的那个连接kit我觉得相当不好用
如果你不愿意换公司
我试过，你就用pcDNA3，用EcoRV切开了，脱磷
就按照平末端普通连接体系做，都比那个kit效果好。
你可以用T7-F和SP6-F检测，空载应该有100bp多
因为你这个可以自己控制脱磷，自己控制空载自连的效率，比那个满天都是自连的好很多
或者，反正你都已经纯化了目的条带了，你也可以平末端产物Taq加A之后，换一个好一点的kit做AT克隆
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18楼2014-03-25 19:49:33
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hmily890404

新虫 (小有名气)
引用回帖:
12楼: Originally posted by zhangj0754 at 2012-12-20 10:36:42
我们也用全式金的，我一般用0.5的载体+1.5的片段（胶回收），50Trans1-T1感受态转化，2000以下的片段很好连的。不过我们之前PCR用的TAKARA的primestar酶。

最近也在连pEASY-BLunt, 都连不上，请问胶回收浓度50左右可以连么？片段2000，用的primestar
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19楼2015-03-25 15:36:18
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小尼姑shaki

禁虫 (小有名气)
本帖内容被屏蔽
20楼2018-09-11 16:48:55
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