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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 平末端连接不上，求助
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蓝慧

木虫 (正式写手)

[求助] 平末端连接不上，求助

大家好，本人最近在做平末端连接，我的PCR产物是混合引物PCR结果，用的是东洋纺的KOD-PLUS-NEO酶，PCR产物用OMEGA胶回收试剂盒进行回收，30微升体积稀释，回收后电泳检测有特异单一条带，浓度大约为150ng/ul，目的片段大小约为1500bp。接着进行连接，用的载体是全式金pEASY-blunt zero clonig KIT,连接体系5微升，包括2微升PCR产物，1微升载体，25度15min,之后50微升感受态转化，涂板，过夜培养，其中培养基为LB。培养后挑选白色菌落摇菌4小时M13引物菌液检测，可是PCR检测只有在100以下有个带，完全没有目的带，已经做了3次都是如此。现在都不知道是什么问题，请求各位虫子指点迷津，不胜感激！
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向着目标前进！
1楼 2012-12-19 10:34:53
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biostar2009

专家顾问 (正式写手)
实话实说，你用的那个连接kit我觉得相当不好用
如果你不愿意换公司
我试过，你就用pcDNA3，用EcoRV切开了，脱磷
就按照平末端普通连接体系做，都比那个kit效果好。
你可以用T7-F和SP6-F检测，空载应该有100bp多
因为你这个可以自己控制脱磷，自己控制空载自连的效率，比那个满天都是自连的好很多
或者，反正你都已经纯化了目的条带了，你也可以平末端产物Taq加A之后，换一个好一点的kit做AT克隆
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18楼2014-03-25 19:49:33
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
蓝慧: 金币+1, ★有帮助 2012-12-19 15:54:41
PCR检测只有小于100的带是引物二聚体吧。你做PCR有做阳性对照吗？确定PCR条件合适？
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2楼2012-12-19 12:10:01
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蓝慧

木虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-12-19 13:10:01
PCR检测只有小于100的带是引物二聚体吧。你做PCR有做阳性对照吗？确定PCR条件合适？

我用的是M13的通用引物，但是没有做过阳性对照，请教如何设计阳性对照？
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向着目标前进！
3楼2012-12-19 12:32:31
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望海思月

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
蓝慧: 金币+1, ★有帮助 2012-12-19 19:32:16
你的连接体系不对吧？平端连接，载体一点点就够了，片段要加大浓度
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4楼2012-12-19 16:26:47
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