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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】关于小片段连接的问题
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plantst5928

铜虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】关于小片段连接的问题 已有7人参与

本人最近要把一个基因分成几个小片段分别连接到载体上去，大约每个片段是60bp。那我应该怎么做？直接合成双链DNA，两边加酶切位点。还是设计引物扩增目的片段，我的片段只有60bp，引物一般都30bp，我怎么延伸啊。我如果直接把引物设计成目的片段，扩PCR的时候只退火不延伸，是不是也能得到目的片段啊。
小弟现在还没开始，心里一直在想哪个方案可行，请做过的高手飘过留下建议。
谢谢！
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1楼 2010-05-07 23:53:43
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fungixx

至尊木虫 (文坛精英)

优秀版主优秀版主优秀版主
★ ★
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plantaqp(金币+1):欢迎多来交流 2010-05-08 04:04:34
只退火不延伸，是不是也能得到目的片段 。。。。。怎么可能啊，直接拿引物做连接不就行了吗，或者说直接酶切引物然后链接到你的载体上 。。。。
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几年前踏上火车那一刻都还没有意识到,从此故乡只有冬夏,再无春秋
2楼2010-05-08 00:37:54
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plantaqp

金虫 (正式写手)
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lstt09nk(金币+1):感谢交流~~ 2010-05-08 12:27:36
楼上说的不对，引物是单链的怎么酶切？

分别合成两条链（带没切接头的），拿到引物后，退火，连接就可以了。
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3楼2010-05-08 04:19:08
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fungixx

至尊木虫 (文坛精英)

优秀版主优秀版主优秀版主
★
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楼上说的对，那就直接那引物退火就行了，呵呵。还是直接合成双链吧
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几年前踏上火车那一刻都还没有意识到,从此故乡只有冬夏,再无春秋
4楼2010-05-08 11:49:12
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★
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直接合双链，59个碱基就好，然后退火，退火完之后刚好就有黏性末端，直接就和酶切的载体连
60个生工就算另外一个档次的价格啦
当然你要更长也没办法
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5楼2010-05-08 13:33:42
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
注意这种小片段最好在4度连过夜，否则很难连
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6楼2010-05-08 13:34:31
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yujiaping1

木虫 (著名写手)
★
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挺感兴趣楼主的实验，为什么要把基因分成这么小的片段呢，这个是什么实验呢？
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7楼2010-05-08 13:51:33
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plantst5928

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 三磷酸腺苷 at 2010-05-08 13:33:42:
直接合双链，59个碱基就好，然后退火，退火完之后刚好就有黏性末端，直接就和酶切的载体连
60个生工就算另外一个档次的价格啦
当然你要更长也没办法

那我的PCR程序怎么设定呢？还要循环码？循环多少呢？
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8楼2010-05-09 23:16:34
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★
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引用回帖:
Originally posted by plantst5928 at 2010-05-09 23:16:34:


那我的PCR程序怎么设定呢？还要循环码？循环多少呢？

不用循环，都不是一个酶促反应
原理就是充分变性后缓慢降温使oligo单链变成双链
你可以去看看碧云天退火buffer的说明书，有写怎么设置
每多少秒降多少度的程序
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9楼2010-05-10 00:34:00
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liyong1981

金虫 (正式写手)
★
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又见碧云天～唉，
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10楼2010-05-13 09:53:41
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