24小时热门版块排行榜    

CyRhmU.jpeg
查看: 1282  |  回复: 10

plantst5928

铜虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】关于小片段连接的问题已有7人参与

本人最近要把一个基因分成几个小片段分别连接到载体上去,大约每个片段是60bp。那我应该怎么做?直接合成双链DNA,两边加酶切位点。还是设计引物扩增目的片段,我的片段只有60bp,引物一般都30bp,我怎么延伸啊。我如果直接把引物设计成目的片段,扩PCR的时候只退火不延伸,是不是也能得到目的片段啊。
小弟现在还没开始,心里一直在想哪个方案可行,请做过的高手飘过留下建议。
谢谢!
回复此楼
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

fungixx

至尊木虫 (文坛精英)

优秀版主优秀版主优秀版主

★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
plantaqp(金币+1):欢迎多来交流 2010-05-08 04:04:34
只退火不延伸,是不是也能得到目的片段 。。。。。怎么可能啊,直接拿引物做连接不就行了吗,或者说直接酶切引物然后链接到你的载体上 。。。。
几年前踏上火车那一刻都还没有意识到,从此故乡只有冬夏,再无春秋
2楼2010-05-08 00:37:54
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

plantaqp

金虫 (正式写手)

★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
lstt09nk(金币+1):感谢交流~~ 2010-05-08 12:27:36
楼上说的不对,引物是单链的怎么酶切?

分别合成两条链(带没切接头的),拿到引物后,退火,连接就可以了。
3楼2010-05-08 04:19:08
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

fungixx

至尊木虫 (文坛精英)

优秀版主优秀版主优秀版主


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
楼上说的对,那就直接那引物退火就行了,呵呵。还是直接合成双链吧
几年前踏上火车那一刻都还没有意识到,从此故乡只有冬夏,再无春秋
4楼2010-05-08 11:49:12
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
直接合双链,59个碱基就好,然后退火,退火完之后刚好就有黏性末端,直接就和酶切的载体连
60个生工就算另外一个档次的价格啦
当然你要更长也没办法
5楼2010-05-08 13:33:42
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)

注意这种小片段最好在4度连过夜,否则很难连
6楼2010-05-08 13:34:31
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yujiaping1

木虫 (著名写手)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
挺感兴趣楼主的实验,为什么要把基因分成这么小的片段呢,这个是什么实验呢?
7楼2010-05-08 13:51:33
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

plantst5928

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by 三磷酸腺苷 at 2010-05-08 13:33:42:
直接合双链,59个碱基就好,然后退火,退火完之后刚好就有黏性末端,直接就和酶切的载体连
60个生工就算另外一个档次的价格啦
当然你要更长也没办法

那我的PCR程序怎么设定呢?还要循环码?循环多少呢?
8楼2010-05-09 23:16:34
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by plantst5928 at 2010-05-09 23:16:34:


那我的PCR程序怎么设定呢?还要循环码?循环多少呢?

不用循环,都不是一个酶促反应
原理就是充分变性后缓慢降温使oligo单链变成双链
你可以去看看碧云天退火buffer的说明书,有写怎么设置
每多少秒降多少度的程序
9楼2010-05-10 00:34:00
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

liyong1981

金虫 (正式写手)



小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
又见碧云天~唉,
10楼2010-05-13 09:53:41
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 plantst5928 的主题更新
普通表情 高级回复(可上传附件)
信息提示
请填处理意见