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plantst5928

铜虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】关于小片段连接的问题 已有7人参与

本人最近要把一个基因分成几个小片段分别连接到载体上去,大约每个片段是60bp。那我应该怎么做?直接合成双链DNA,两边加酶切位点。还是设计引物扩增目的片段,我的片段只有60bp,引物一般都30bp,我怎么延伸啊。我如果直接把引物设计成目的片段,扩PCR的时候只退火不延伸,是不是也能得到目的片段啊。
小弟现在还没开始,心里一直在想哪个方案可行,请做过的高手飘过留下建议。
谢谢!
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by plantst5928 at 2010-05-09 23:16:34:


那我的PCR程序怎么设定呢?还要循环码?循环多少呢?

不用循环,都不是一个酶促反应
原理就是充分变性后缓慢降温使oligo单链变成双链
你可以去看看碧云天退火buffer的说明书,有写怎么设置
每多少秒降多少度的程序
9楼2010-05-10 00:34:00
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fungixx

至尊木虫 (文坛精英)

优秀版主优秀版主优秀版主

★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
plantaqp(金币+1):欢迎多来交流 2010-05-08 04:04:34
只退火不延伸,是不是也能得到目的片段 。。。。。怎么可能啊,直接拿引物做连接不就行了吗,或者说直接酶切引物然后链接到你的载体上 。。。。
几年前踏上火车那一刻都还没有意识到,从此故乡只有冬夏,再无春秋
2楼2010-05-08 00:37:54
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plantaqp

金虫 (正式写手)

★ ★
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lstt09nk(金币+1):感谢交流~~ 2010-05-08 12:27:36
楼上说的不对,引物是单链的怎么酶切?

分别合成两条链(带没切接头的),拿到引物后,退火,连接就可以了。
3楼2010-05-08 04:19:08
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fungixx

至尊木虫 (文坛精英)

优秀版主优秀版主优秀版主


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
楼上说的对,那就直接那引物退火就行了,呵呵。还是直接合成双链吧
几年前踏上火车那一刻都还没有意识到,从此故乡只有冬夏,再无春秋
4楼2010-05-08 11:49:12
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