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yugari_nagi

铁虫 (初入文坛)

[求助] 【酶连】三片段连接总是做不出来,求助! 已有3人参与

目前我手头有三个待连接的片段

片段1:含抗性基因和ori的载体骨架 ~4kb  BamHI SpeI酶切
片段2:目标基因1 ~4kb   SpeI SalI 酶切
片段3:目标基因2 ~0.7kb  BamHI XbaI酶切

片段1,2,3按1:1:5的比例用T4 ligase 4度过夜酶联后转化,板上没有长出阳性克隆,或者出现假阳性,做了几次都没做出来

请问各位有那里可以改进的呢?
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鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
三片段连接没做过,不过建议一段一段的连接。可以用中间载体。坐等大神解答。
2楼2014-03-05 09:11:22
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鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)

哪个比例不知道怎么算的?
还有,T4不是16度过夜吗?
3楼2014-03-05 09:12:16
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yugari_nagi

铁虫 (初入文坛)

引用回帖:
3楼: Originally posted by 鬼羽帝魂 at 2014-03-05 09:12:16
哪个比例不知道怎么算的?
还有,T4不是16度过夜吗?

摩尔比1:1:5   先测浓度,再根据大小算摩尔浓度

4度过夜或16度1小时,都OK吧
4楼2014-03-05 09:26:12
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liu208xj

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
酶切后,跑胶回收后再做连接
5楼2014-03-05 09:56:52
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yugari_nagi

铁虫 (初入文坛)

引用回帖:
5楼: Originally posted by liu208xj at 2014-03-05 09:56:52
酶切后,跑胶回收后再做连接

片段都是切胶回收的
6楼2014-03-05 10:05:15
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鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)

引用回帖:
4楼: Originally posted by yugari_nagi at 2014-03-05 09:26:12
摩尔比1:1:5   先测浓度,再根据大小算摩尔浓度

4度过夜或16度1小时,都OK吧...

我们实验室用的是全式金的,粘端连接:20-25度10min;平端连接:20-25度2h或16度过夜。
7楼2014-03-05 10:56:45
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liygmail

至尊木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-03-05 14:48:36
酶切载体片段同时连接两个外源片段,理论上是没问题的,但实际上,还是分段连接可行性大。
此外,如果片段多,也可以采用例如CPEC或gibson组装方法实现无缝多片段组装
8楼2014-03-05 12:19:25
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