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yugari_nagi

铁虫 (初入文坛)

应助: 1 (幼儿园)
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在线: 30.2小时
虫号: 1394491
注册: 2011-09-08
专业: 微生物遗传育种学

[求助] 【酶连】三片段连接总是做不出来，求助！已有3人参与

目前我手头有三个待连接的片段

片段1：含抗性基因和ori的载体骨架 ~4kb BamHI SpeI酶切
片段2：目标基因1 ~4kb SpeI SalI 酶切
片段3：目标基因2 ~0.7kb BamHI XbaI酶切

片段1，2，3按1：1：5的比例用T4 ligase 4度过夜酶联后转化，板上没有长出阳性克隆，或者出现假阳性，做了几次都没做出来

请问各位有那里可以改进的呢？

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1楼2014-03-05 08:43:54

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liygmail

至尊木虫 (职业作家)

MolEPI: 1
应助: 31 (小学生)
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在线: 820.3小时
虫号: 280786
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性别: GG
专业: 微生物遗传育种学

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-03-05 14:48:36

酶切载体片段同时连接两个外源片段，理论上是没问题的，但实际上，还是分段连接可行性大。
此外，如果片段多，也可以采用例如CPEC或gibson组装方法实现无缝多片段组装

8楼2014-03-05 12:19:25

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