【答案】应助回帖

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:

酶切质粒DNA选什么材料比较好？已经有5人回复
PCR产物经酶切电泳后所得的基因型与测序结果不一致，是何原因？该如何处理？已经有10人回复
载体连接pcr片段一直连不上已经有17人回复
急求！！植物叶片中硝酸还原酶、谷酰胺合成酶、天门冬酰胺合成酶活性的测定方法已经有10人回复
求教关于用QIAquick PCR Purification Kit 是否能用来回收双酶切过的pcr产物已经有3人回复
设计引物时酶切位点保护碱基的问题已经有8人回复
【求助/交流】xho1单酶切，总连不上(片段3K,载体5K) 已经有8人回复
【求助/交流】求助、质粒酶切没有条带？已经有18人回复
【求助/交流】双酶切求助已经有19人回复
求双酶切，分步酶切的具体操作步骤已经有7人回复

1楼2011-09-05 21:45:00

wanhscn

木虫 (职业作家)

哲学@草根

MolEPI: 26
应助: 53 (初中生)
贵宾: 0.87
金币: 3900.7
散金: 877
红花: 27
沙发: 14
帖子: 3640
在线: 526小时
虫号: 1376762
注册: 2011-08-22
性别: GG
专业: 植物遗传学

【答案】应助回帖

★ ★
dhd997(金币+2): 鼓励热心版版 2011-09-06 07:38:23
shuihaizi(金币+2): 2011-09-06 08:59:19

载体或者目的片段去磷酸化，否则载体自连的较多，不易挑到！

真相是最大的奢侈品

2楼2011-09-05 22:09:31

瓶儿花

金虫 (小有名气)

MolEPI: 3
应助: 0 (幼儿园)
金币: 988.2
红花: 6
帖子: 219
在线: 63.4小时
虫号: 1091730
注册: 2010-09-07
性别: MM
专业: 微生物生理与生物化学

【答案】应助回帖

★ ★
wanhscn(金币+2): 比较准确！ 2011-09-06 09:58:28
shuihaizi(金币+2): 2011-09-06 11:52:14

载体去磷酸化，不然会自连，目的片段可以不用去磷酸化的。做的时候加对照，以不加目的片段，只加酶切并去磷酸化的载体的连接液为对照，就能知道你载体去磷酸化的效果了。

3楼2011-09-06 09:53:27

wanhscn

木虫 (职业作家)

哲学@草根

MolEPI: 26
应助: 53 (初中生)
贵宾: 0.87
金币: 3900.7
散金: 877
红花: 27
沙发: 14
帖子: 3640
在线: 526小时
虫号: 1376762
注册: 2011-08-22
性别: GG
专业: 植物遗传学

引用回帖:

2楼: Originally posted by wanhscn at 2011-09-05 22:09:31:
载体或者目的片段去磷酸化，否则载体自连的较多，不易挑到！

表述有误，载体必须去磷酸化！

赞一下

真相是最大的奢侈品

4楼2011-09-06 10:00:01

shuihaizi

金虫 (小有名气)

应助: 9 (幼儿园)
金币: 45.8
散金: 282
红花: 2
沙发: 1
帖子: 146
在线: 209.3小时
虫号: 713966
注册: 2009-03-03
性别: MM
专业: 植物生理与生化

你们的意思是没有去磷酸化，连上的可能性很小是吗?
另外，是不是因为我的目的片段太大啊？快和载体一样大了，不知道怎么样的连接比例较好？

赞一下

5楼2011-09-06 11:51:57

瓶儿花

金虫 (小有名气)

MolEPI: 3
应助: 0 (幼儿园)
金币: 988.2
红花: 6
帖子: 219
在线: 63.4小时
虫号: 1091730
注册: 2010-09-07
性别: MM
专业: 微生物生理与生物化学

【答案】应助回帖

★ ★
wanhscn(金币+2): good 2011-09-06 14:13:54
shuihaizi(金币+2): 2011-09-06 16:25:18

目的片段比较大没有关系的，载体必须要去磷酸化的，因为你做的是单酶切。没有去磷酸化很容易自连。连接的反应体系不应过大。体系过大，浓度越低，分子碰撞的概率越低，这样连接的概率也就越低了。一般连接的反应体系为10μL.
载体 1μL
目的片段 7μL
10×T4 DNA ligase 1μL
T4 DNA ligase 1μL
16℃连接过夜。
注意要加好对照，这样便于你分析结果。
祝你好运！

6楼2011-09-06 12:33:28

36894256

金虫 (小有名气)

应助: 1 (幼儿园)
金币: 957.4
散金: 15
帖子: 63
在线: 12.5小时
虫号: 507809
注册: 2008-02-19
专业: 生物化学

【答案】应助回帖

shuihaizi(金币+2): 2011-09-06 16:25:35

应该好连的你连过夜后你可以转化前跑一个核酸电泳对照一下与你连接的东西之后再用 xl10-gold菌转化指定能连上的

赞一下

7楼2011-09-06 13:30:17

hjpcy

新虫 (初入文坛)

应助: 0 (幼儿园)
金币: 11.4
帖子: 11
在线: 3.4小时
虫号: 1162859
注册: 2010-12-05

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
shuihaizi(金币+3): 2011-09-06 16:26:05
西瓜(金币+5): Good 2011-09-06 17:25:33

1.如果是用T4连接酶，按20ul体系：
载体 100ng
目的片段 500-1000ng
10×T4 DNA ligase 2μL
T4 DNA ligase 1μL
25℃连接30min。
片段不需去磷
2.如果用快速克隆酶（该方法阳性率很高）
载体 100ng
目的片段 100-300ng
10×快速克隆酶buffer 2μL
快速克隆酶 2μL
25℃连接30min。
片段不需去磷

本人构建过二十多个克隆，90%一次性成功

8楼2011-09-06 14:15:23