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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 酶切连接连不上，要死了
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lierhan

铁虫 (小有名气)
★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-07-16 15:49:51
一步法法克隆看起来貌似很方便呢，我最近目的基因连表达载体也总是连接不上，不知道可不可以试试这种方法。感觉大家说很对，单酶切载体的话最好去磷酸化，防止载体自连；双酶切载体的化就不需要了，保证酶切完全就行了。
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21楼2014-07-10 20:22:11
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dizang2

新虫 (小有名气)
引用回帖:
11楼: Originally posted by zhaoxiaopang at 2014-07-09 20:53:05
用我设计的引物P目的片段能P出来，然后转化后长出来的点在菌落PCR用的还是同样的引物，就是P不出来...

像这么长的片段不知你怎么设计的鉴定的引物，可以在中间设计引物，太长的话不好P ，另外P 长的片段需要提高镁离子的浓度！
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22楼2014-07-16 16:42:01
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虚心竹

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

你用的是哪个公司的一步法试剂盒，我最近也在做，用的是ECORI 单酶
切，做了一次，没做出来，不知道这试剂盒效率到底高不高
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23楼2014-12-23 22:50:21
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鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
9楼: Originally posted by zhaoxiaopang at 2014-07-09 20:13:40
载体单酶切37度过夜，胶回收。片段P出来也是单一条带再胶回收。然后就在连接体系是20UL，用的是一步克隆的试剂盒，连接半小时直接做转化。复苏后涂平板200Ul. 过夜长出来是满满一平板，挑单菌落做菌落PCR什么都P不 ...

你这个载体是是单酶切的，回收之后要去磷酸化，但是这样不好做
如果可以，你设计引物在载体上加上别的酶切位点A、B，设计片段两端也加上A、B。 这样，顺利的话，一周就做出来了。
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24楼2014-12-24 11:08:34
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