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lierhan

铁虫 (小有名气)

★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流! 2014-07-16 15:49:51
一步法法克隆看起来貌似很方便呢,我最近目的基因连表达载体也总是连接不上,不知道可不可以试试这种方法。感觉大家说很对,单酶切载体的话最好去磷酸化,防止载体自连;双酶切载体的化就不需要了,保证酶切完全就行了。
21楼2014-07-10 20:22:11
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dizang2

新虫 (小有名气)

引用回帖:
11楼: Originally posted by zhaoxiaopang at 2014-07-09 20:53:05
用我设计的引物P目的片段能P出来,然后转化后长出来的点在菌落PCR用的还是同样的引物,就是P不出来...

像这么长的片段不知你怎么设计的鉴定的引物,可以在中间设计引物,太长的话不好P ,另外P 长的片段需要提高镁离子的浓度!
22楼2014-07-16 16:42:01
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虚心竹

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

你用的是哪个公司的一步法试剂盒,我最近也在做,用的是ECORI 单酶
切,做了一次,没做出来,不知道这试剂盒效率到底高不高
23楼2014-12-23 22:50:21
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鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
9楼: Originally posted by zhaoxiaopang at 2014-07-09 20:13:40
载体单酶切37度过夜,胶回收。片段P出来也是单一条带再胶回收。然后就在连接体系是20UL,用的是一步克隆的试剂盒,连接半小时直接做转化。复苏后涂平板200Ul. 过夜长出来是满满一平板,挑单菌落做菌落PCR什么都P不 ...

你这个载体是是单酶切的,回收之后要去磷酸化,但是这样不好做
如果可以,你设计引物在载体上加上别的酶切位点A、B,设计片段两端也加上A、B。 这样,顺利的话,一周就做出来了。
24楼2014-12-24 11:08:34
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