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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 酶切连接连不上，要死了
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zhaoxiaopang

金虫 (小有名气)
引用回帖:
10楼: Originally posted by jamesfeng at 2014-07-09 20:51:08
综合楼主信息可以得出，应该是片段连接到载体上的效率太低，转化的都是空载体质粒，有条件的话，重新设计引物，基因片段通过T5，与切好的线性载体连接。

用我设计的引物P目的片段能P出来，然后转化后长出来的点在菌落PCR用的还是同样的引物，就是P不出来
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11楼2014-07-09 20:53:05
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游侠892

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-07-16 15:48:25
既然你用一步法试剂盒做，为什么不考虑用双酶切来酶切载体呢？双酶切只是将载体切开，目标片段又不需要酶切，也不存在酶切位点的问题。单酶切如果载体不去磷酸化的话，同样可以自连呀，如果P不出带来，那估计就是自连了。建议重新做双酶切了。
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路漫漫其修远兮，吾将上下而求索
12楼2014-07-09 20:58:03
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jamesfeng

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-07-16 15:48:37
同学你用过T5没？ 我意思是用这个方法 基因片段5‘和3’端都必须有与载体片段切口端有15bp左右 的overlap,如果同学没用过的话，可以找找该方法的文献看看！这个方法如有条件的话，非常好用
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13楼2014-07-09 20:58:29
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jamesfeng

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
12楼: Originally posted by 游侠892 at 2014-07-09 20:58:03
既然你用一步法试剂盒做，为什么不考虑用双酶切来酶切载体呢？双酶切只是将载体切开，目标片段又不需要酶切，也不存在酶切位点的问题。单酶切如果载体不去磷酸化的话，同样可以自连呀，如果P不出带来，那估计就是自 ...

重新双酶切，那一切都得从来，lz估计是做表达用的！
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14楼2014-07-09 21:09:00
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dizang2

新虫 (小有名气)
★
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖交流！ 2014-07-16 15:49:00
单酶切需要用CIP去磷
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15楼2014-07-10 03:23:38
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可帅儿

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-07-16 15:49:10
NdeI单酶切最好去一下磷酸化，而且也要做个自连对照。像你这种长得满满一板肯定不正常，而且不可能挑一个就是对的，只能多挑几个克隆。要不然你设计用双酶切，相对稳定一点~
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追随自己的心！不要做让自己后悔的事！
16楼2014-07-10 12:23:48
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zhang宇微

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流经验！ 2014-07-16 15:49:20
单酶切阳性率很低，可以在连接体系中加上0.8ul的酶，多挑几个克隆验证，四五十个克隆都不算多。师姐说单酶切都挑80个克隆

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17楼2014-07-10 12:50:35
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yudaoqian88

至尊木虫 (知名作家)

不良人

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-07-16 15:49:35
不要胶回收连接，有杂带的话用巢试PCR富集！菌液除菌液PCR检测外，再粗体质粒检测！可以参考我的硕士论文:亚洲棉种皮特异启动子的克隆及表达载体构建。希望对你有所帮助！

[ 发自小木虫客户端 ]
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特别喜欢家门口开门的瞬间，宝宝那个高兴呀，蹦蹦跳跳，好不热闹！
18楼2014-07-10 13:18:58
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zhaoxiaopang

金虫 (小有名气)
引用回帖:
13楼: Originally posted by jamesfeng at 2014-07-09 20:58:29
同学你用过T5没？ 我意思是用这个方法 基因片段5‘和3’端都必须有与载体片段切口端有15bp左右 的overlap,如果同学没用过的话，可以找找该方法的文献看看！这个方法如有条件的话，非常好用

我觉得你说的那个方法跟我的这个一步克隆的方法是一样的，我的也是有同源臂，但是用这个方法连接了好几次均不成功，郁闷死了，现在考虑载体单酶切线性化应该没有问题，感受态貌似也不会有问题，现在总是连不上但是能在抗性平板上长就觉得是片段的问题
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19楼2014-07-10 19:26:10
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jamesfeng

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

引用回帖:
19楼: Originally posted by zhaoxiaopang at 2014-07-10 19:26:10
我觉得你说的那个方法跟我的这个一步克隆的方法是一样的，我的也是有同源臂，但是用这个方法连接了好几次均不成功，郁闷死了，现在考虑载体单酶切线性化应该没有问题，感受态貌似也不会有问题，现在总是连不上但是 ...

可能吧，也有可能基因有毒性抑制了宿主细胞的生长
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20楼2014-07-10 19:44:22
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