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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 酶切连接连不上，要死了
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zhaoxiaopang

金虫 (小有名气)

[求助] 酶切连接连不上，要死了 已有10人参与

如题，最近构建质粒，载体是pIMP，使用的是单酶切位点Nde1.然后用一步克隆的方法做连接转化，感受态是DH5&，做了四五次都是连不上，长出来的单菌落做PCR结果目的条带都P不出来，不知道是什么原因。换了新的一步克隆试剂盒做对比依然还是连不上，求大神分析分析啊。。。。。。
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1楼 2014-07-08 15:37:24
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zhaoxiaopang

金虫 (小有名气)
引用回帖:
13楼: Originally posted by jamesfeng at 2014-07-09 20:58:29
同学你用过T5没？ 我意思是用这个方法 基因片段5‘和3’端都必须有与载体片段切口端有15bp左右 的overlap,如果同学没用过的话，可以找找该方法的文献看看！这个方法如有条件的话，非常好用

我觉得你说的那个方法跟我的这个一步克隆的方法是一样的，我的也是有同源臂，但是用这个方法连接了好几次均不成功，郁闷死了，现在考虑载体单酶切线性化应该没有问题，感受态貌似也不会有问题，现在总是连不上但是能在抗性平板上长就觉得是片段的问题
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19楼2014-07-10 19:26:10
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jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
zhaoxiaopang(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-07-08 18:14:47
具体步骤怎样啊？可能的原因太多了。
最好使用双酶切，减少自连接的机会，而且可以确定连接的顺序正确。
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2楼2014-07-08 16:25:35
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seven拂晓

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
zhaoxiaopang(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-07-11 11:09:24
有好多原因呢 不如详细说说你的实验过程
我前两天构建质粒也是遇到了问题，现在找到原因了 是因为酶切时间太长了（说明书上写着过夜不会出现星号活性，我切4个小时就不行了）。
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3楼2014-07-09 08:48:17
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393658000

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
可以私信我，我可以教你如何弄！
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4楼2014-07-09 11:13:21
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