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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 急求酶切，回收及连接详细操作步骤
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zuohuihui

木虫 (正式写手)

[求助] 急求酶切，回收及连接详细操作步骤 已有1人参与

由于之前做酶切连接一直不成功，按照大家给我的建议我也试了一下，但转化时还是一个菌落都不长，我的详细操作步骤是：
首先PCR扩增目的片段，连T载体，双酶切看有无大小合适片段被切下来，切成功后送测序，确保目的片段正确。然后分别双酶切载体和T载体，我采用的30ul体系，载体加10ul，T载体加15ul，酶切两份T载体，跑胶，凝胶回收。我的载体和T载体都是取过夜摇的菌液3-4ml，12000rmp离心收菌，天根小提试剂盒提取质粒。回收也是按照天根试剂盒说明书进行，最后中体积40ul，但5ul酶切回收的载体及目的片段跑胶，载体几乎看不到条带，测了一下浓度，很低，目的片段浓度还可以，按照载体和目的片段浓度1:9，用takara的solutionI进行连接，原本30度连接半小时，没有成功，后来尝试16度过夜也没有菌落生成，而且我的感受态也是新做的，做此实验一个多月了一直没有成功，因为在生物知识方面经验很少，还请各位多多帮忙分析原因，或者麻烦你们把你们的详细操作告知一下，非常非常感谢
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1楼 2013-07-08 11:45:38
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

zuohuihui

木虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by dcb005 at 2013-07-08 11:58:34
T载体一般很好连，可以蓝白斑筛选，建议看看你用的Taq酶有没有A 尾巴，没有的话，不可能连接成功

T载体一连就成功了，就是载体很难切开，切了几次都感觉没有条带被切下来
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4楼2013-07-08 13:46:12
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普通回帖

dcb005

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
zuohuihui: 金币+2, ★★★★★最佳答案 2013-07-08 13:46:31
myprayer: 金币+1, 回答很好，perfect 2013-07-08 17:06:37
T载体一般很好连，可以蓝白斑筛选，建议看看你用的Taq酶有没有A 尾巴，没有的话，不可能连接成功
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★穷则独善其身,达则兼济天下★
2楼2013-07-08 11:58:34
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华农夏田

铁虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 鼓励发帖积极交流，分子生物期待你更多精彩 2013-07-08 17:06:49
载体酶切浓度低吧
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要科研也要生活
3楼2013-07-08 12:42:15
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zuohuihui

木虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 华农夏田 at 2013-07-08 12:42:15
载体酶切浓度低吧

我也觉得是这方面的问题，可是不知道怎么回事载体很难切开，只有这一次感觉切开了，所以就试试能不能连上
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5楼2013-07-08 13:47:37
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肃清华书

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
zuohuihui(gyesang代发): 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-07-22 19:07:19
载体难切开应该是有两个问题，一个是酶浓度，一个是酶活性。如果载体选择的没什么问题的话就从这两个方面改进吧，或者反应时间长点也行。
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6楼2013-07-13 22:09:37
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Haibara_Ai

铜虫 (小有名气)
你载体是什么o ri gin，为什么只切5ul

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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7楼2013-07-14 07:38:15
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alicelchf

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

T载体3小时就可以，尽力小体积，另外检查下你的pcr产物是否正确电泳
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修身、齐家、治国、平天下
8楼2013-07-14 10:49:50
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华农夏田

铁虫 (正式写手)
★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流经验！ 2013-07-22 19:07:37
引用回帖:
5楼: Originally posted by zuohuihui at 2013-07-08 13:47:37
我也觉得是这方面的问题，可是不知道怎么回事载体很难切开，只有这一次感觉切开了，所以就试试能不能连上...

这个星期我也构建了个真核质粒，前边还蛮顺利的，不连T载体，直接酶切质粒载体和目的片段，回收连接，都两天了，没长菌落。前边跑胶回收怀疑是浓度低了！你做得怎样了？
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要科研也要生活
9楼2013-07-22 16:40:50
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yayasci

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

我也在做构建表达载体，载体倒是切开了，我用的是20ul的体系，载体加1ug.你可以质粒提取后测下浓度再根据量来加载体进行酶切。酶切时间在六小时以上。
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10楼2013-12-09 22:49:20
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