| 查看: 3514 | 回复: 10 | ||
| 当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖 | ||
zuohuihui木虫 (正式写手)
|
[求助]
急求酶切，回收及连接详细操作步骤已有1人参与
|
|
|
由于之前做酶切连接一直不成功，按照大家给我的建议我也试了一下，但转化时还是一个菌落都不长，我的详细操作步骤是： 首先PCR扩增目的片段，连T载体，双酶切看有无大小合适片段被切下来，切成功后送测序，确保目的片段正确。然后分别双酶切载体和T载体，我采用的30ul体系，载体加10ul，T载体加15ul，酶切两份T载体，跑胶，凝胶回收。我的载体和T载体都是取过夜摇的菌液3-4ml，12000rmp离心收菌，天根小提试剂盒提取质粒。回收也是按照天根试剂盒说明书进行，最后中体积40ul，但5ul酶切回收的载体及目的片段跑胶，载体几乎看不到条带，测了一下浓度，很低，目的片段浓度还可以，按照载体和目的片段浓度1:9，用takara的solutionI进行连接，原本30度连接半小时，没有成功，后来尝试16度过夜也没有菌落生成，而且我的感受态也是新做的，做此实验一个多月了一直没有成功，因为在生物知识方面经验很少，还请各位多多帮忙分析原因，或者麻烦你们把你们的详细操作告知一下，非常非常感谢 |
回复此楼» 猜你喜欢
为什么蛋白质氨基酸测定大家都测17种?
已经有5人回复
-
《灰分记：我与坩埚的“灰烬”之恋》
已经有3人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有61人回复
-
求助 食品检验工（基础知识），中国劳动社会出版社 电子版
已经有5人回复
-
胶体几丁质的结晶度？
已经有0人回复
-
诚挚招收全日制博士！！！中国农业科学院麻类研究所谭志坚研究员课题组招收博士
已经有2人回复
-
三甲基羟乙基丙二胺的合成路线
已经有5人回复
» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
T4酶切连接求助！
已经有17人回复- 双酶切后切胶回收
已经有34人回复
- 有没有用过XmnI这个酶的?酶切后连接需要注意什么问题么？
已经有12人回复
- 双酶切后目的条带很淡，回收不到
已经有15人回复
- 各种综合问题：酶切 胶回收 质粒浓缩 测浓度
已经有7人回复
- 目的基因片段胶回收后酶切，然后再跑胶后发现条带很弱，怎么改进（求助）
已经有8人回复
- 载体和酶切片段连接的问题
已经有5人回复
- 连接产物双酶切
已经有11人回复
- 平末端连接做不出来克隆
已经有30人回复
- 酶切后未纯化连接出现的问题
已经有18人回复
- 内切酶和连接酶buffer的选择
已经有10人回复
- 单酶切连接的问题
已经有4人回复
- 有谁试过双酶切的同时加碱性磷酸酶
已经有4人回复
- PCR ， 双酶切，连接问题
已经有17人回复
- 【求助】基因克隆T载体酶切问题等
已经有8人回复
- 双酶切连接表达载体，两个月都没做出来，问题到底出在哪里呢~？求指点
已经有52人回复
- 为什么我做的酶切连接总是不长斑呢？
已经有24人回复
- 【求助/交流】质粒构建步骤，回答的好，还有几十金币追加！！！！
已经有13人回复
- 【求助/交流】大家酶切载体怎么切？一般切多久？
已经有6人回复
- 【求助/交流】质粒pPICZA酶切问题
已经有5人回复
- 求双酶切，分步酶切的具体操作步骤
已经有7人回复
6楼2013-07-13 22:09:37
dcb005
金虫 (著名写手)
- 应助: 28 (小学生)
- 贵宾: 0.005
- 金币: 1108.8
- 散金: 110
- 红花: 2
- 帖子: 1850
- 在线: 103.1小时
- 虫号: 275937
- 注册: 2006-09-02
- 性别: GG
- 专业: 生物化学
2楼2013-07-08 11:58:34
3楼2013-07-08 12:42:15
zuohuihui
木虫 (正式写手)
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 2104.7
- 散金: 604
- 帖子: 918
- 在线: 143.2小时
- 虫号: 1263983
- 注册: 2011-04-13
- 性别: GG
- 专业: 化学生物学与生物有机化学
4楼2013-07-08 13:46:12