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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 存档旧帖 » 各种综合问题：酶切 胶回收 质粒浓缩 测浓度
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QUENIX2321

铁虫 (初入文坛)

[求助] 各种综合问题：酶切 胶回收 质粒浓缩 测浓度

我要罢工了……
求助各位虫友：
1.有关双酶切胶回收之后的回收效率问题：
    EcoRI XhoI 双酶切体系：
    酶各2ul
      BUFFER H 4ul
      模板DNA 1ug
      ddH20 up to 40 ul
     酶切 37℃ 4-5h
     10Xloading buffer 4ul 终止酶切
   跑出来的条带亮
2.用TAKARA做胶回收
3.测浓度-Eppendorf BioPhotometer Plus核酸蛋白测定仪
问题：为什么测出来的是负值？只有0D260 0D280为零

4.有关质粒DNA浓缩
原来是由于提出来的质粒 OD比过大 所以想用乙醇沉淀法浓缩质粒DNA
之前做过相关的实验（当时情况是40ng/ul OD比1.8左右 4支浓缩之后为148ng/ul)
这次做了之后用Eppendorf BioPhotometer Plus核酸蛋白测定仪测浓度 值各种崩溃（有正常的 也有负值 也有无0）为同一批一同沉淀进行的 我不明白是不是其中的实验哪步有差错 但本人确实不太知道
方法：1/10V 醋酸钠 +2.5V冷无水乙醇 -20℃保存30-60min
          12000r 离心5-10分钟 弃液
      用冷乙醇清洗沉淀 干燥
      用30-50ulH20清洗 离心可得。
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1楼 2012-11-28 16:35:17
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zhaodahe

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
回收后跑电泳亮度如何呢？别太纠结测的浓度，我们基本是不测的，都是直接往后做。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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2楼2012-11-28 19:07:24
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QUENIX2321

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by zhaodahe at 2012-11-28 19:07:24
回收后跑电泳亮度如何呢？别太纠结测的浓度，我们基本是不测的，都是直接往后做。

哦？
那酶切之后 胶回收 那个做连接时 不测浓度 那个量是怎么掌握的?
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3楼2012-11-28 22:45:54
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zhaodahe

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by QUENIX2321 at 2012-11-28 22:45:54
哦？
那酶切之后 胶回收 那个做连接时 不测浓度 那个量是怎么掌握的?...

跑电泳，看相对的亮度。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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4楼2012-11-29 00:11:05
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bloodwar

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
跑电泳看个亮度就行了。质粒DNA浓缩时，你不放心最好做个40ml体系的大培养，再来纯化，绝对保险。另外，你会不会是分光光度计没使用对啊
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5楼2012-11-29 05:09:02
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chenguestc

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
1，请先确定回收是成功的，可以取回收DNA 2微升跑个胶即可。如果A260，280值是0，只能说明没有回收成功，或者你的NANOTROP出了问题。
2，用其他人的原来已经测过浓度的质粒，用这个机器测一下看是否是机器的问题。。。。。
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6楼2012-11-29 08:52:33
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QUENIX2321

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by chenguestc at 2012-11-29 08:52:33
1，请先确定回收是成功的，可以取回收DNA 2微升跑个胶即可。如果A260，280值是0，只能说明没有回收成功，或者你的NANOTROP出了问题。
2，用其他人的原来已经测过浓度的质粒，用这个机器测一下看是否是机器的问题。 ...

改用 微量核酸检测仪进行检测
质粒浓缩的OD比为1.8-1.9 浓浓缩浓度为100-140ng/ul

那个之前用的仪器 使用方法没有变 测过的 使用方法一样 我不太明白为什么有的时候能出来值 而大多数时间 我用的时候出来的值都让我很崩溃 因为我实验室其他师兄师姐用我测出来的值都满正常的 OD也都在1.9附近 但我不知道 是不是灵敏度的问题 他们的值一般都是200-300ng/ul
而我的样品一般只有100左右 而经过酶切 胶回收之后的话 就只有20-30ng/ul
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7楼2012-11-30 17:33:06
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QUENIX2321

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by bloodwar at 2012-11-29 05:09:02
跑电泳看个亮度就行了。质粒DNA浓缩时，你不放心最好做个40ml体系的大培养，再来纯化，绝对保险。另外，你会不会是分光光度计没使用对啊

分光光度计 我使用时 让师姐在一旁看了 。。。。 操作上面应该没有出差错
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8楼2012-11-30 17:33:45
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