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关于切胶回收后有质粒污染和拼接PCR涂抹装条带的问题,有点长,呵呵
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yabxxh
木虫
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[交流]
关于切胶回收后有质粒污染和拼接PCR涂抹装条带的问题,有点长,呵呵
是这样的,
我要克隆一个3k的基因,此基因前段高GC(局部84%),我分成了两段来克隆,并且这两段都是经过亚克隆并且测序成功的。前段我称为K前(1647bp),后段K后(1456bp)。
K前连接酶克隆在表达载体上,K后平端拓扑克隆在T载体上。
用同样体积的质粒做模版PCR,K前有杂带,切胶回收后无杂带;K后也有杂带,切胶回收后有大于目的条带的两条杂带。
已经经过无数次的拼接,始终都得到涂抹带,程序是成熟的,以前都没有问题,不过以前我是用的突变平拼接得到的K后(因为要突变掉K后尾端的一个酶切位点),拼接没问题;现在亚克隆到T载体上,经过测序也是正确的,以之为模版PCR、切胶回收后就出现污染条带,与K前拼接全是涂抹带。
目前,包括酶、引物、水甚至是PCR管和枪头都更换了一遍全新的,仍然是涂抹带。
恳请各路英雄不吝赐教、指点迷津,在下谢过了。
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西瓜
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1楼
2011-06-25 20:42:39
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qhuzhl
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yabxxh(金币
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):谢谢参与
我不懂,太高深了,呵呵
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8楼
2011-06-25 22:21:49
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yabxxh
木虫
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?,那些EPI达人们呢
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10楼
2011-06-27 14:05:25
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西瓜
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★
yabxxh(金币
+1
):谢谢参与
送鲜花一朵
不懂,帮顶下
有图片的话最好放上来啊。
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11楼
2011-06-27 17:10:10
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ty1987
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yabxxh(金币
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确实听着好高深啊!
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12楼
2011-06-27 18:19:43
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tangbohejin
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13楼
2011-06-27 19:08:52
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tangbohejin
2楼
2011-06-25 21:14
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yabxxh(金币
+1
):谢谢参与
媛媛1223
3楼
2011-06-25 21:29
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yabxxh(金币
+1
):谢谢参与
祝福
z550178854z
4楼
2011-06-25 21:35
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yabxxh(金币
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):谢谢参与
祝福
tangbohejin
5楼
2011-06-25 21:45
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leimiao_hit
6楼
2011-06-25 21:53
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yabxxh(金币
+1
):谢谢参与
引用回帖:
Originally posted by
yabxxh
at 2011-06-25 20:42:39: 是这样的, 我要克隆一个3k的基因,此基因前段高GC(局部84%),我分成了两段来克隆,并且这两段都是经过亚克隆并且测序成功的。前段我称为K前(1647bp),后段K后(1456bp)。 K前连接酶克隆在表达载体上,K后 ...
祝福
zxzqcwk
7楼
2011-06-25 22:00
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yabxxh(金币
+1
):谢谢参与
pindiyou
9楼
2011-06-25 22:39
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yabxxh(金币
+1
):谢谢参与
骚人追月
14楼
2011-06-27 21:10
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yabxxh(金币
+1
):谢谢参与
祝福
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