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[交流]
关于切胶回收后有质粒污染和拼接PCR涂抹装条带的问题，有点长，呵呵
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是这样的， 我要克隆一个3k的基因，此基因前段高GC（局部84%），我分成了两段来克隆，并且这两段都是经过亚克隆并且测序成功的。前段我称为K前（1647bp），后段K后（1456bp）。 K前连接酶克隆在表达载体上，K后平端拓扑克隆在T载体上。 用同样体积的质粒做模版PCR，K前有杂带，切胶回收后无杂带；K后也有杂带，切胶回收后有大于目的条带的两条杂带。 已经经过无数次的拼接，始终都得到涂抹带，程序是成熟的，以前都没有问题，不过以前我是用的突变平拼接得到的K后（因为要突变掉K后尾端的一个酶切位点），拼接没问题；现在亚克隆到T载体上，经过测序也是正确的，以之为模版PCR、切胶回收后就出现污染条带，与K前拼接全是涂抹带。 目前，包括酶、引物、水甚至是PCR管和枪头都更换了一遍全新的，仍然是涂抹带。 恳请各路英雄不吝赐教、指点迷津，在下谢过了。 |
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