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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 关于切胶回收后有质粒污染和拼接PCR涂抹装条带的问题，有点长，呵呵
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yabxxh

木虫 (正式写手)

[交流] 关于切胶回收后有质粒污染和拼接PCR涂抹装条带的问题，有点长，呵呵

是这样的，
我要克隆一个3k的基因，此基因前段高GC（局部84%），我分成了两段来克隆，并且这两段都是经过亚克隆并且测序成功的。前段我称为K前（1647bp），后段K后（1456bp）。
K前连接酶克隆在表达载体上，K后平端拓扑克隆在T载体上。
用同样体积的质粒做模版PCR，K前有杂带，切胶回收后无杂带；K后也有杂带，切胶回收后有大于目的条带的两条杂带。
已经经过无数次的拼接，始终都得到涂抹带，程序是成熟的，以前都没有问题，不过以前我是用的突变平拼接得到的K后（因为要突变掉K后尾端的一个酶切位点），拼接没问题；现在亚克隆到T载体上，经过测序也是正确的，以之为模版PCR、切胶回收后就出现污染条带，与K前拼接全是涂抹带。
目前，包括酶、引物、水甚至是PCR管和枪头都更换了一遍全新的，仍然是涂抹带。
恳请各路英雄不吝赐教、指点迷津，在下谢过了。
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西瓜

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1楼 2011-06-25 20:42:39
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qhuzhl

金虫 (小有名气)
★
yabxxh(金币+1):谢谢参与
我不懂，太高深了，呵呵
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8楼2011-06-25 22:21:49
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yabxxh

木虫 (正式写手)
？，那些EPI达人们呢
赞一下 回复此楼
10楼2011-06-27 14:05:25
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)
★
yabxxh(金币+1):谢谢参与
送鲜花一朵

不懂，帮顶下
有图片的话最好放上来啊。
赞一下(1人) 回复此楼
11楼2011-06-27 17:10:10
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ty1987

金虫 (小有名气)
★
yabxxh(金币+1):谢谢参与
确实听着好高深啊！
赞一下(1人) 回复此楼
12楼2011-06-27 18:19:43
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tangbohejin

木虫之王 (文学泰斗)
真心祝福-----------
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13楼2011-06-27 19:08:52
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tangbohejin2楼
2011-06-25 21:14   回复  
yabxxh(金币+1):谢谢参与
媛媛12233楼
2011-06-25 21:29   回复  
yabxxh(金币+1):谢谢参与
祝福
z550178854z4楼
2011-06-25 21:35   回复  
yabxxh(金币+1):谢谢参与
祝福
tangbohejin5楼
2011-06-25 21:45   回复  
leimiao_hit6楼
2011-06-25 21:53   回复  
yabxxh(金币+1):谢谢参与
引用回帖:
Originally posted by yabxxh at 2011-06-25 20:42:39: 是这样的， 我要克隆一个3k的基因，此基因前段高GC（局部84%），我分成了两段来克隆，并且这两段都是经过亚克隆并且测序成功的。前段我称为K前（1647bp），后段K后（1456bp）。 K前连接酶克隆在表达载体上，K后 ...

祝福
zxzqcwk7楼
2011-06-25 22:00   回复  
yabxxh(金币+1):谢谢参与
pindiyou9楼
2011-06-25 22:39   回复  
yabxxh(金币+1):谢谢参与
骚人追月14楼
2011-06-27 21:10   回复  
yabxxh(金币+1):谢谢参与
祝福
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