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btx362237729

金虫 (正式写手)

[交流] 神奇的质粒提取，花儿一样神奇的单酶切跑胶！

引言：本人小硕，开始做构建，从实验组其他同学那里要来pcDNA3.1(+)做真核表达载体，一开始酶切就遇到了问题，特来请教！感谢大家指教！

下图为用同学给的pcDNA3.1(+)转化DH5α之后，手提质粒、试剂盒提质粒、3种酶单酶切试剂盒提取质粒的1%琼脂糖电泳图

M: takara的DL 10,000 Marker 1. BamHⅠ单酶切 2. HindⅢ单酶切 3. XhoⅠ单酶切
4. takara试剂盒提取的质粒 5. 碱裂解法酚氯仿抽提的质粒 6. 同学给的质粒pcDNA3.1(+)

单酶切条件为：17ul试剂盒提取的质粒+1ul酶+2ul K Buffer 共20ul体系，37℃水浴4小时

单酶切都切成花朵了，哈哈，不知道有人遇到这个问题没！！！
请教大家这到底是怎么回事？好像同学给的质粒跑胶条带也有问题，怎么两条亮带呢。。。应该不是mRNA，在冰箱放很久了。

下图是试剂盒提取的质粒和手提质粒pcDNA3.1(+)

123为试剂盒提取，456为碱裂解法酚氯仿抽提
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1楼2012-05-31 22:36:53
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张宏宇123

金虫 (著名写手)
★
btx362237729(金币+1): 谢谢参与
你酶切浓度有点大吧，你胶浓度是多大，可以增大胶浓度。
质粒放时间长了，线状的质粒就会多
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3楼2012-05-31 23:02:51
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genetics183

木虫 (正式写手)
★
btx362237729(金币+1): 谢谢参与
建议：
1. 电泳时上样量可以少一点；
2. 酶切体系中质粒加少点。
再试试看。
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4楼2012-05-31 23:06:11
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btx362237729

金虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 张宏宇123 at 2012-05-31 23:02:51
你酶切浓度有点大吧，你胶浓度是多大，可以增大胶浓度。
质粒放时间长了，线状的质粒就会多

酶切浓度是什么意思？
其他实验室用的体系是17ul质粒+1ul酶+2ul buffer  切得不错 所以让我也这样做。

是不是他们提的质粒浓度太低，而我的质粒浓度又太高了呢？
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7楼2012-05-31 23:37:13
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btx362237729

金虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 张宏宇123 at 2012-05-31 23:02:51
你酶切浓度有点大吧，你胶浓度是多大，可以增大胶浓度。
质粒放时间长了，线状的质粒就会多

1%的胶
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8楼2012-05-31 23:37:34
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btx362237729

金虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by genetics183 at 2012-05-31 23:06:11
建议：
1. 电泳时上样量可以少一点；
2. 酶切体系中质粒加少点。
再试试看。

是指的质粒量少加点吗？我是跑胶后染色的，偏亮貌似比较正常

酶切加了17ul质粒，体系是20ul，确实很多，但是别人这样做效果很好，不知道是不是我的质粒浓度太高了
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9楼2012-05-31 23:38:54
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bioqu4

银虫 (小有名气)
★ ★
btx362237729(金币+1): 谢谢参与
btx362237729: 金币+1, 非常感谢 2012-06-01 10:41:48
我觉得应该是酶切体系中质粒量加得太多了。
别人是这样的体系，但别人的质粒浓度和你的是一样的吗？
一般来说，20微升酶切体系只需要加1-6微升用试剂盒提的质粒。质粒加得太多，当然酶切就很困难。
建议你质粒加少点（比如3微升），再做一遍看看。
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16楼2012-06-01 06:39:43
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btx362237729

金虫 (正式写手)
引用回帖:
16楼: Originally posted by bioqu4 at 2012-06-01 06:39:43
我觉得应该是酶切体系中质粒量加得太多了。
别人是这样的体系，但别人的质粒浓度和你的是一样的吗？
一般来说，20微升酶切体系只需要加1-6微升用试剂盒提的质粒。质粒加得太多，当然酶切就很困难。
建议你质粒加 ...

恩 酶切条带下面有未切开的超螺旋，目前可以确定是质粒太多了

跑成花儿是因为酶切产物上样太多。。。其实也就5ul，但是因为质粒多所以浓了

感谢你的回答
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17楼2012-06-01 09:34:54
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淘气维尼89

木虫 (小有名气)
★ ★
btx362237729(金币+1): 谢谢参与
btx362237729: 金币+1 2012-06-01 10:41:30
你酶切加的质粒太多了吧，第二张的质粒电泳图还不错，就是浓度太高了。酶切位点是不是有问题，质粒应该是空质粒吧？
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18楼2012-06-01 09:47:39
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btx362237729

金虫 (正式写手)
引用回帖:
18楼: Originally posted by 淘气维尼89 at 2012-06-01 09:47:39
你酶切加的质粒太多了吧，第二张的质粒电泳图还不错，就是浓度太高了。酶切位点是不是有问题，质粒应该是空质粒吧？

是的 空质粒。。。。。三种酶分别切的，酶切位点应该没问题
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19楼2012-06-01 10:15:54
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张宏宇123

金虫 (著名写手)
★
btx362237729: 金币+1 2012-06-01 10:41:22
引用回帖:
7楼: Originally posted by btx362237729 at 2012-05-31 23:37:13
酶切浓度是什么意思？
其他实验室用的体系是17ul质粒+1ul酶+2ul buffer  切得不错 所以让我也这样做。

是不是他们提的质粒浓度太低，而我的质粒浓度又太高了呢？...

你质粒切的量确实很大啊，以你提的量，我感觉你切3-5ul就够了。你切切试试。
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20楼2012-06-01 10:18:13
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btx362237729

金虫 (正式写手)
引用回帖:
20楼: Originally posted by 张宏宇123 at 2012-06-01 10:18:13
你质粒切的量确实很大啊，以你提的量，我感觉你切3-5ul就够了。你切切试试。...

切5ul  够后面的胶回收和连接吗？
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21楼2012-06-01 10:38:13
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张宏宇123

金虫 (著名写手)
★ ★ ★ ★
btx362237729: 金币+4, 非常感谢哦 2012-06-01 12:37:36
引用回帖:
21楼: Originally posted by btx362237729 at 2012-06-01 10:38:13
切5ul  够后面的胶回收和连接吗？...

够，而且你这个是载体，载体量不用很多，片段要求量要多，切片段的时候可以多切点。但也不要切17ul，切10ul就可以了。其余的体积用ddH2O补足就行。你试试
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22楼2012-06-01 11:53:16
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btx362237729

金虫 (正式写手)
引用回帖:
22楼: Originally posted by 张宏宇123 at 2012-06-01 11:53:16
够，而且你这个是载体，载体量不用很多，片段要求量要多，切片段的时候可以多切点。但也不要切17ul，切10ul就可以了。其余的体积用ddH2O补足就行。你试试...

真心感谢
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23楼2012-06-01 12:37:20
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张宏宇123

金虫 (著名写手)
引用回帖:
23楼: Originally posted by btx362237729 at 2012-06-01 12:37:20
真心感谢

...

不客气
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24楼2012-06-01 14:14:22
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btx362237729

金虫 (正式写手)
重新切了5ul质粒 条件不变 貌似依然没切完
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25楼2012-06-01 20:09:29
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酶切专家

金虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
像花一样是因为你的制胶是琼脂糖没有完全溶解，质粒出现两条带或三条带都算正常（超螺旋和线性或环状）
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26楼2012-06-01 22:49:21
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酶切专家

金虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
如果要保证完全酶切，你最好对质粒进行定量，根据质量的量加入足够的限制性内切酶，具体可以参考doulbe digestion designer, 小木虫上有，你可以试试。
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27楼2012-06-01 22:52:26
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btx362237729

金虫 (正式写手)
引用回帖:
26楼: Originally posted by 酶切专家 at 2012-06-01 22:49:21
像花一样是因为你的制胶是琼脂糖没有完全溶解，质粒出现两条带或三条带都算正常（超螺旋和线性或环状）

不会吧。。我的琼脂糖都反复沸腾4次的。。。。。为什么其他条带不像花儿一样呢？
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28楼2012-06-01 23:16:35
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btx362237729

金虫 (正式写手)
引用回帖:
27楼: Originally posted by 酶切专家 at 2012-06-01 22:52:26
如果要保证完全酶切，你最好对质粒进行定量，根据质量的量加入足够的限制性内切酶，具体可以参考doulbe digestion designer, 小木虫上有，你可以试试。

不完全酶切有什么坏处呢？反正都要切胶，没切开的不要不就好了吗？
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29楼2012-06-01 23:17:25
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j2

木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
试一下上样量低点，上样的时候缓一点
质粒浓度挺高的，酶切的时候质粒量低点吧，用ddH2O补足
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30楼2012-06-02 10:35:14
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btx362237729

金虫 (正式写手)
引用回帖:
30楼: Originally posted by j2 at 2012-06-02 10:35:14
试一下上样量低点，上样的时候缓一点
质粒浓度挺高的，酶切的时候质粒量低点吧，用ddH2O补足

上样量降至2ul酶切产物 毫无效果。。。。。
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31楼2012-06-02 13:11:57
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我是小纯洁

金虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
酶切的时候，加4ul载体就撑死了，你还加17ul。。。
你可以这样尝试一下：4ul载体，3ul酶，4ul buffer，29ul水。
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32楼2012-06-03 11:28:20
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yingyangyang

木虫 (正式写手)
★
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引用回帖:
9楼: Originally posted by btx362237729 at 2012-05-31 23:38:54
是指的质粒量少加点吗？我是跑胶后染色的，偏亮貌似比较正常

酶切加了17ul质粒，体系是20ul，确实很多，但是别人这样做效果很好，不知道是不是我的质粒浓度太高了...

虽然都是加17uL 但是你们加的质粒的浓度未必一样啊！  17uL是威力保持酶切体系为20uL。  你的质粒浓度过高的话，你应该稀释下，或者少加点补水到17uL。   我当时做酶切就只加了4.5uL质粒，然后补水的。  用1%的胶电泳。  你如果是浓度过高的话，你可以吧质粒做不同梯度的稀释，然后分别酶切，跑电泳。 选取一个适合你的浓度来进行酶切呢！！  也可以电泳时把酶切产物做个梯度稀释然后跑，选个适合的电泳上样量。  跑胶时要是样品上样过大，跑出来会有开花的样子的。我出现过这个情况。
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33楼2012-06-03 14:49:10
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wangfei179

木虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
质粒浓度降到8ul试试。
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34楼2012-06-03 16:00:04
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btx362237729

金虫 (正式写手)
引用回帖:
34楼: Originally posted by wangfei179 at 2012-06-03 16:00:04
质粒浓度降到8ul试试。

额。。。5ul都切不完  降到1l条带都很清楚
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35楼2012-06-03 19:29:11
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syhorchid2楼
2012-05-31 22:54   回复  
btx362237729(金币+1): 谢谢参与
见证20115楼
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zhuyanmei6楼
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许愿天使10楼
2012-05-31 23:39   回复  
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奋力拼搏11楼
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Scifinder212楼
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xuguolanyin13楼
2012-06-01 00:17   回复  
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fengmeiyi14楼
2012-06-01 00:28   回复  
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zhaoyanmei15楼
2012-06-01 00:32   回复  
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