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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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btx362237729

金虫 (正式写手)


[交流] 神奇的质粒提取,花儿一样神奇的单酶切跑胶!

引言:本人小硕,开始做构建,从实验组其他同学那里要来pcDNA3.1(+)做真核表达载体,一开始酶切就遇到了问题,特来请教!感谢大家指教!

下图为用同学给的pcDNA3.1(+)转化DH5α之后,手提质粒、试剂盒提质粒、3种酶单酶切试剂盒提取质粒的1%琼脂糖电泳图

M: takara的DL 10,000 Marker 1. BamHⅠ单酶切 2. HindⅢ单酶切 3. XhoⅠ单酶切
4. takara试剂盒提取的质粒 5. 碱裂解法酚氯仿抽提的质粒 6. 同学给的质粒pcDNA3.1(+)

单酶切条件为:17ul试剂盒提取的质粒+1ul酶+2ul K Buffer 共20ul体系,37℃水浴4小时

单酶切都切成花朵了,哈哈,不知道有人遇到这个问题没!!!
请教大家这到底是怎么回事?好像同学给的质粒跑胶条带也有问题,怎么两条亮带呢。。。应该不是mRNA,在冰箱放很久了。

下图是试剂盒提取的质粒和手提质粒pcDNA3.1(+)

123为试剂盒提取,456为碱裂解法酚氯仿抽提

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张宏宇123

金虫 (著名写手)


★ ★ ★ ★
btx362237729: 金币+4, 非常感谢哦 2012-06-01 12:37:36
引用回帖:
21楼: Originally posted by btx362237729 at 2012-06-01 10:38:13
切5ul  够后面的胶回收和连接吗?...

够,而且你这个是载体,载体量不用很多,片段要求量要多,切片段的时候可以多切点。但也不要切17ul,切10ul就可以了。其余的体积用ddH2O补足就行。你试试
22楼2012-06-01 11:53:16
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张宏宇123

金虫 (著名写手)



btx362237729(金币+1): 谢谢参与
你酶切浓度有点大吧,你胶浓度是多大,可以增大胶浓度。
质粒放时间长了,线状的质粒就会多
3楼2012-05-31 23:02:51
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genetics183

木虫 (正式写手)



btx362237729(金币+1): 谢谢参与
建议:
1. 电泳时上样量可以少一点;
2. 酶切体系中质粒加少点。
再试试看。
4楼2012-05-31 23:06:11
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btx362237729

金虫 (正式写手)


引用回帖:
3楼: Originally posted by 张宏宇123 at 2012-05-31 23:02:51
你酶切浓度有点大吧,你胶浓度是多大,可以增大胶浓度。
质粒放时间长了,线状的质粒就会多

酶切浓度是什么意思?
其他实验室用的体系是17ul质粒+1ul酶+2ul buffer  切得不错 所以让我也这样做。

是不是他们提的质粒浓度太低,而我的质粒浓度又太高了呢?
7楼2012-05-31 23:37:13
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