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btx362237729

金虫 (正式写手)

[交流] 神奇的质粒提取，花儿一样神奇的单酶切跑胶！

引言：本人小硕，开始做构建，从实验组其他同学那里要来pcDNA3.1(+)做真核表达载体，一开始酶切就遇到了问题，特来请教！感谢大家指教！

下图为用同学给的pcDNA3.1(+)转化DH5α之后，手提质粒、试剂盒提质粒、3种酶单酶切试剂盒提取质粒的1%琼脂糖电泳图

M: takara的DL 10,000 Marker 1. BamHⅠ单酶切 2. HindⅢ单酶切 3. XhoⅠ单酶切
4. takara试剂盒提取的质粒 5. 碱裂解法酚氯仿抽提的质粒 6. 同学给的质粒pcDNA3.1(+)

单酶切条件为：17ul试剂盒提取的质粒+1ul酶+2ul K Buffer 共20ul体系，37℃水浴4小时

单酶切都切成花朵了，哈哈，不知道有人遇到这个问题没！！！
请教大家这到底是怎么回事？好像同学给的质粒跑胶条带也有问题，怎么两条亮带呢。。。应该不是mRNA，在冰箱放很久了。

下图是试剂盒提取的质粒和手提质粒pcDNA3.1(+)

123为试剂盒提取，456为碱裂解法酚氯仿抽提
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1楼 2012-05-31 22:36:53
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yingyangyang

木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
9楼: Originally posted by btx362237729 at 2012-05-31 23:38:54
是指的质粒量少加点吗？我是跑胶后染色的，偏亮貌似比较正常

酶切加了17ul质粒，体系是20ul，确实很多，但是别人这样做效果很好，不知道是不是我的质粒浓度太高了...

虽然都是加17uL 但是你们加的质粒的浓度未必一样啊！  17uL是威力保持酶切体系为20uL。  你的质粒浓度过高的话，你应该稀释下，或者少加点补水到17uL。   我当时做酶切就只加了4.5uL质粒，然后补水的。  用1%的胶电泳。  你如果是浓度过高的话，你可以吧质粒做不同梯度的稀释，然后分别酶切，跑电泳。 选取一个适合你的浓度来进行酶切呢！！  也可以电泳时把酶切产物做个梯度稀释然后跑，选个适合的电泳上样量。  跑胶时要是样品上样过大，跑出来会有开花的样子的。我出现过这个情况。
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33楼2012-06-03 14:49:10
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张宏宇123

金虫 (著名写手)
★
btx362237729(金币+1): 谢谢参与
你酶切浓度有点大吧，你胶浓度是多大，可以增大胶浓度。
质粒放时间长了，线状的质粒就会多
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3楼2012-05-31 23:02:51
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genetics183

木虫 (正式写手)
★
btx362237729(金币+1): 谢谢参与
建议：
1. 电泳时上样量可以少一点；
2. 酶切体系中质粒加少点。
再试试看。
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4楼2012-05-31 23:06:11
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btx362237729

金虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 张宏宇123 at 2012-05-31 23:02:51
你酶切浓度有点大吧，你胶浓度是多大，可以增大胶浓度。
质粒放时间长了，线状的质粒就会多

酶切浓度是什么意思？
其他实验室用的体系是17ul质粒+1ul酶+2ul buffer  切得不错 所以让我也这样做。

是不是他们提的质粒浓度太低，而我的质粒浓度又太高了呢？
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7楼2012-05-31 23:37:13
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