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生化与分子

新虫 (初入文坛)

[求助] 目的基因片段胶回收后酶切，然后再跑胶后发现条带很弱，怎么改进（求助）

我要做目的基因的超表达，构建载体的第一步就遇到了困难，我在克隆了目的基因跑胶后做双酶切，然后再跑胶，发现目的条带很弱，根本没有回收的必要了，怎么改进才能得到较亮的酶切条带？请各位帮忙提点儿建议，不胜感激！
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1楼 2012-10-30 21:31:53
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
你酶切回收后不是该做连接了吗，为什么还要再回收呢？做连接不用很多DNA呀。如果想得到更多的回收产物，加大初始反应体系和DNA的量。
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2楼2012-10-31 07:37:21
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huangguoqing

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-10-31 15:18:04
个人建议，仅供参考！
1.扩增之后直接进行酶切，然后再对酶切产物进行胶回收；
2.胶回收效率本来就很低，无论是国产还是进口的试剂盒，反复胶回收肯定量很少；
3.我之前用过Omega的试剂盒，感觉不错；
4.胶回收最后的一步可以更换为ddH2O，更有益于克隆。
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3楼2012-10-31 10:34:16
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考研生涯

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-10-31 15:18:15
PCR之后如果没有出现非特异性条带，直接做个PCR纯化就行了，要是非特异性条带比较多的话，建议胶回收，酶切之后验证一下就直接连接，不需要在胶回收了。PCR体系可以大点，比如2或者3*50ul。
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4楼2012-10-31 11:06:14
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david0308

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-10-31 15:18:42
两种解决方案：1.一般来说如果PCR产物是单一条带的话，可以直接PCR产物回收，然后做双酶切，这样又简单产率也很高而且可以避免更多的突变产生。如果你的目的基因是在文库中拉的话那么其实第二步也可以直接产物回收的。2.如果担心纯度问题的话，最好还是割胶回收，但是呢，要加大PCR的量，而且在胶回收的过程中可以适当的改进，比如说胶回收在过柱子的过程中可以反复过滤3遍，提高产率，DDH2O少加一点，也可以的。
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哈哈
5楼2012-10-31 13:19:25
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zd0017

铁虫 (小有名气)
★
myprayer: 金币+1, 屏蔽内容, 应楼主要求，屏蔽咯 2013-05-12 15:55:45
本帖内容被屏蔽
6楼2013-05-12 10:12:31
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linhehu

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

如果基因片段不长的话，建议直接用PCR，把目的片段直接扩增出来，回收好后做连接
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在知识的海洋里裸泳
7楼2013-06-11 19:30:17
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xipha

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

条带弱不要紧啊，只要看得到就可以了，我们组还有人根本看不到，就着位置切结果还连出来了。不过条带弱的话，建议PCR完了一定要先过一下柱或者胶回收一下，除去引物二聚体，不然酶切的时候，引物二聚体都是最容易反应的。一般酶切后条带如果太亮反倒要担心酶切不完全，搞不好连不上，弱一点很正常。建议先回收了连连看。
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8楼2013-11-16 03:16:35
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yayasci

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

建议回收胶制浓度稍微大点，这样分辨率高些
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9楼2013-12-08 22:18:57
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