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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 目的片段与表达载体怎么都连接不上
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张冰宝

新虫 (小有名气)

[求助] 目的片段与表达载体怎么都连接不上 已有3人参与

最近一直在做原核表达，回收后的目的片段与表达载体pet-32a怎么都连接不上，已经试过十多次了，转化阳性质粒确定感受态和板子都没有问题。pet-32a没有问题（因为别的同门就连接上了），目的基因已经经过测序没有问题，就是胶回收后条带偏高一些。我重新回收了好几次结果都偏高。但是我同门回收的也偏高就连上了。。操作应该没有问题，连了半个多月了就是连不上，恳请知道的大侠们能指点一二，看看我这到底是哪出问题了，谢谢大家了
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1楼 2014-07-20 17:38:55
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by 张冰宝 at 2014-07-28 12:51:08
谢谢你 ，我已经找到问题了，主要出在我的目的片段上...

恩啊   好好总结下经验   祝你实验顺利
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10楼2014-07-28 14:39:00
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张冰宝

新虫 (小有名气)
引用回帖:
10楼: Originally posted by 鬼羽帝魂 at 2014-07-28 14:39:00
恩啊   好好总结下经验   祝你实验顺利...

非常感谢大家的帮助
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12楼2014-07-29 08:50:39
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普通回帖

gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2014-07-21 08:25:46
你是如何判断没有连上的？
板子上没有长出克隆还是长出了克隆经过鉴定都是假阳性，要说出你的现象，否则简单的连不上可能原因太多了。
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学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
2楼2014-07-20 21:20:56
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张冰宝

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by gyesang at 2014-07-20 21:20:56
你是如何判断没有连上的？
板子上没有长出克隆还是长出了克隆经过鉴定都是假阳性，要说出你的现象，否则简单的连不上可能原因太多了。

有两次板子长了两三个克隆，我做的菌液pcr证实是假阳性。其他的就都是空板子了
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3楼2014-07-21 08:26:21
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主
引用回帖:
3楼: Originally posted by 张冰宝 at 2014-07-21 08:26:21
有两次板子长了两三个克隆，我做的菌液pcr证实是假阳性。其他的就都是空板子了...

再说说你的连接体系和连接条件吧
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学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
4楼2014-07-27 20:48:02
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不爱做实验

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
张冰宝(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-07-28 11:12:02
方法一：交给你同门，让他做
方法二：参考同门的体系
方法三：重新再做一次，保证每一步没问题
总结：我最近也连不上，每一步又没什么问题，有的时候可能多少和运气有关吧。
另外，尝试将回收的片段用量提高，连接时间再延长，可以尝试连接一天一夜。
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5楼2014-07-28 10:21:20
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鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

上体系    上条件    上你的载体、片段的大小、浓度等详细信息
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6楼2014-07-28 10:55:02
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张冰宝

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by gyesang at 2014-07-20 21:20:56
你是如何判断没有连上的？
板子上没有长出克隆还是长出了克隆经过鉴定都是假阳性，要说出你的现象，否则简单的连不上可能原因太多了。

谢谢大家的帮忙，已经连接上了 今天去测序了。主要的原因还是我回收的目的片段有问题。
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7楼2014-07-28 12:49:30
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张冰宝

新虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 不爱做实验 at 2014-07-28 10:21:20
方法一：交给你同门，让他做
方法二：参考同门的体系
方法三：重新再做一次，保证每一步没问题
总结：我最近也连不上，每一步又没什么问题，有的时候可能多少和运气有关吧。
另外，尝试将回收的片段用量提高，连 ...

感谢你的帮助 ，我已经连上了 ，你说的那些我都试过了，主要原因是回收的不好。胶跑的时间不够长
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8楼2014-07-28 12:50:38
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张冰宝

新虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 鬼羽帝魂 at 2014-07-28 10:55:02
上体系    上条件    上你的载体、片段的大小、浓度等详细信息

谢谢你 ，我已经找到问题了，主要出在我的目的片段上
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9楼2014-07-28 12:51:08
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