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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 目的片段载体片段连接不长菌
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ninglihua

新虫 (初入文坛)

[求助] 目的片段载体片段连接不长菌 已有5人参与

求助：
      目前在做连接反应，目的片段3.7kb，载体片段5.5kb，均为双酶切后胶回收获得，将目的片段和载体片段进行连接，连接体系25ul(目的片段10ul，载体6ul，10*T4ligase buffer 2.5ul ,T4 ligase1ul)用的TAKALA家的T4连接酶试剂盒，16度连接过夜，化学转化，图板，均不长菌。做了阳性对照证明感受态和平板都是没有问题的，但为什么连接不长菌的，一个都不长，求各位大侠相助！帮帮忙吧
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1楼 2014-07-18 10:05:44
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

张冰宝

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
ninglihua(gyesang代发): 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-07-18 15:33:26
你切胶回收后跑胶验证了吗？条带是否正确？回收浓度是否比较高。一般浓度较低不易连接。你的两个酶切位点离得是否太近？双酶切后跑胶不易验证。载体如果没有切开也是连接不上的。
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3楼2014-07-18 10:45:27
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鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+3, 鼓励回帖交流！ 2014-07-18 15:33:40
连接体系25ul(目的片段10ul，载体6ul，10*T4ligase buffer 2.5ul ,T4 ligase1ul。。。
这个太大了吧。
你试试这个：
     载体：19.8X载体大小/（1000X载体浓度）ul
        片段：99X片段大小/（1000X片段浓度）ul
        T4酶：  1ul
     10XT4 buffer：1ul
----------------------------------------------
                            10ul       16度8-10h或过夜

上面公式中载体：片段的摩尔比为1:5，如果载体、片段的浓度太小而需要大量加的时候，你按相同的比例缩减所加的量。但载体的量为30-50ng是至少的。
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4楼2014-07-18 15:02:42
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jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
载体0.03 pM，片段0.3 pM，100 μl菌不超过10 μl连接产物，全部细菌涂上。
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6楼2014-07-18 16:27:05
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xzy0425

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+4, 鼓励回帖交流！ 2014-07-18 18:16:21
我觉得你可以考虑以下几点：
1、酶切位点是否合适，包括位置和酶切位点数量；
2、目的基因插入序列方向是否正确；
3、筛选条件是否合适，如你插入的位点是否位于相应抗性基因内部；
4、目的基因与载体片段是否成功回收到；
5、所回收的载体片段是否是自己需要的那一部分；
6、检查BUFFER与酶是否匹配；
7、限制性内切酶是否真的失活了。
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7楼2014-07-18 16:54:08
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ninglihua

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by songzuowei at 2014-07-18 10:33:04
不长菌的原因可能有：1，片段和载体没有酶切完全没有产生相同的粘性末端，检查酶切位点是否正确，用的酶是否正确，酶是否失效，两种酶公用的反应buffer是否选择正确2.连接问题 连接酶是否失效

谢谢。酶切是没有问题的，酶切胶回收后我将目的片段和载体片段都跑了电泳，条带正确。不知是否是连接酶失效，我今天换了种连接酶，明天希望有好结果~
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8楼2014-07-19 20:43:35
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可帅儿

银虫 (正式写手)
★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-07-27 21:12:43
对呀，回收下来的产物浓度怎样，应该要有20-30ng/ul最好。要保证回收下来有东西
我以前做连接的时候用的15ul体系：载体3ul，片段7ul，T4 buf 1.5ul，T4酶1ul
连接温度22摄氏度   差不多1小时就够了
像你的片段这么大就要考虑在体系里多加些了，尽量加到8-8.5ul。体系里多一点没有太大问题的
仅供参考
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追随自己的心！不要做让自己后悔的事！
13楼2014-07-22 16:56:27
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ninglihua

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
13楼: Originally posted by 可帅儿 at 2014-07-22 16:56:27
对呀，回收下来的产物浓度怎样，应该要有20-30ng/ul最好。要保证回收下来有东西
我以前做连接的时候用的15ul体系：载体3ul，片段7ul，T4 buf 1.5ul，T4酶1ul
连接温度22摄氏度   差不多1小时就够了
像你的片段这 ...

恩，谢谢啦。我连上了！在加连接酶之前我热激了一下，使大片段的超螺旋结构解开，再加酶连接。长菌了。
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时光镇
14楼2014-07-24 09:33:32
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普通回帖

songzuowei

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
ninglihua(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-07-18 10:39:29
ninglihua: 金币+1, ★★★很有帮助 2014-07-19 20:40:58
不长菌的原因可能有：1，片段和载体没有酶切完全没有产生相同的粘性末端，检查酶切位点是否正确，用的酶是否正确，酶是否失效，两种酶公用的反应buffer是否选择正确2.连接问题 连接酶是否失效
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2楼2014-07-18 10:33:04
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鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 鬼羽帝魂 at 2014-07-18 15:02:42
连接体系25ul(目的片段10ul，载体6ul，10*T4ligase buffer 2.5ul ,T4 ligase1ul。。。
这个太大了吧。
你试试这个：
     载体：19.8X载体大小/（1000X载体浓度）ul
        片段：99X片段大小/（1000X片段浓度 ...

体系补水到10ul。
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5楼2014-07-18 15:03:33
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ninglihua

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 张冰宝 at 2014-07-18 10:45:27
你切胶回收后跑胶验证了吗？条带是否正确？回收浓度是否比较高。一般浓度较低不易连接。你的两个酶切位点离得是否太近？双酶切后跑胶不易验证。载体如果没有切开也是连接不上的。

切胶回收后跑胶验证了，条带清楚位置正确
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9楼2014-07-19 20:45:05
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ninglihua

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 鬼羽帝魂 at 2014-07-18 15:02:42
连接体系25ul(目的片段10ul，载体6ul，10*T4ligase buffer 2.5ul ,T4 ligase1ul。。。
这个太大了吧。
你试试这个：
     载体：19.8X载体大小/（1000X载体浓度）ul
        片段：99X片段大小/（1000X片段浓度 ...

谢谢，我试一下。希望能有好结果
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10楼2014-07-19 20:46:11
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