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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 目的片段载体片段连接不长菌
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鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)
引用回帖:
10楼: Originally posted by ninglihua at 2014-07-19 20:46:11
谢谢，我试一下。希望能有好结果...

祝成功
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11楼2014-07-22 10:52:37
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鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)
引用回帖:
10楼: Originally posted by ninglihua at 2014-07-19 20:46:11
谢谢，我试一下。希望能有好结果...

可成功？如果还没有的话，可以告诉我 我帮你分析下
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ninglihua
12楼2014-07-22 10:53:26
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可帅儿

银虫 (正式写手)
★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-07-27 21:12:43
对呀，回收下来的产物浓度怎样，应该要有20-30ng/ul最好。要保证回收下来有东西
我以前做连接的时候用的15ul体系：载体3ul，片段7ul，T4 buf 1.5ul，T4酶1ul
连接温度22摄氏度   差不多1小时就够了
像你的片段这么大就要考虑在体系里多加些了，尽量加到8-8.5ul。体系里多一点没有太大问题的
仅供参考
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追随自己的心！不要做让自己后悔的事！
13楼2014-07-22 16:56:27
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ninglihua

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
13楼: Originally posted by 可帅儿 at 2014-07-22 16:56:27
对呀，回收下来的产物浓度怎样，应该要有20-30ng/ul最好。要保证回收下来有东西
我以前做连接的时候用的15ul体系：载体3ul，片段7ul，T4 buf 1.5ul，T4酶1ul
连接温度22摄氏度   差不多1小时就够了
像你的片段这 ...

恩，谢谢啦。我连上了！在加连接酶之前我热激了一下，使大片段的超螺旋结构解开，再加酶连接。长菌了。
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时光镇
14楼2014-07-24 09:33:32
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ninglihua

新虫 (初入文坛)
送红花一朵
引用回帖:
12楼: Originally posted by 鬼羽帝魂 at 2014-07-22 10:53:26
可成功？如果还没有的话，可以告诉我 我帮你分析下...

谢谢，成功了，已经长菌了，提了质粒，现在送去测序了
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15楼2014-07-24 09:35:05
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谁知道

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
14楼: Originally posted by ninglihua at 2014-07-24 09:33:32
恩，谢谢啦。我连上了！在加连接酶之前我热激了一下，使大片段的超螺旋结构解开，再加酶连接。长菌了。...

请问你是怎么热激的啊？我也总是连不上。
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每个人一辈子从来都是一个人
16楼2014-10-11 09:31:19
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Ramesess

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
14楼: Originally posted by ninglihua at 2014-07-24 09:33:32
恩，谢谢啦。我连上了！在加连接酶之前我热激了一下，使大片段的超螺旋结构解开，再加酶连接。长菌了。...

楼主，请问你热激是多少度啊？多少分钟
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17楼2015-10-05 13:51:02
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Jolly小白

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
14楼: Originally posted by ninglihua at 2014-07-24 09:33:32
恩，谢谢啦。我连上了！在加连接酶之前我热激了一下，使大片段的超螺旋结构解开，再加酶连接。长菌了。...

你好，我现在也遇到这种情况，我的目的片段3000多，载体4731，现在也是连接之后不长菌，想请问一下你是怎么热激的？？？
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18楼2017-11-23 13:13:14
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SS悦

新虫 (初入文坛)
楼主 我也遇到同样问题 不长菌 请问你是怎么做的热激呢？能否解答一下 在线等！！

发自小木虫IOS客户端
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19楼2018-10-21 17:10:36
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时光镇

铁虫 (初入文坛)
送红花一朵
引用回帖:
14楼: Originally posted by ninglihua at 2014-07-24 09:33:32
恩，谢谢啦。我连上了！在加连接酶之前我热激了一下，使大片段的超螺旋结构解开，再加酶连接。长菌了。...

请问你当时热激温度是多少，我最近也在做大片段连接，也是连接不上，涂板不长菌，感受态验证过没问题，我的目的片段大概在7kb左右，载体是PUC118线性载体（大概3.1kb）
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20楼2022-04-11 11:11:46
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