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ninglihua

新虫 (初入文坛)

应助: 0 (幼儿园)
金币: 15
红花: 1
帖子: 7
在线: 2.5小时
虫号: 1620357
注册: 2012-02-16
性别: MM
专业: 药剂学

[求助] 目的片段载体片段连接不长菌已有5人参与

求助：
目前在做连接反应，目的片段3.7kb，载体片段5.5kb，均为双酶切后胶回收获得，将目的片段和载体片段进行连接，连接体系25ul(目的片段10ul，载体6ul，10*T4ligase buffer 2.5ul ,T4 ligase1ul)用的TAKALA家的T4连接酶试剂盒，16度连接过夜，化学转化，图板，均不长菌。做了阳性对照证明感受态和平板都是没有问题的，但为什么连接不长菌的，一个都不长，求各位大侠相助！帮帮忙吧

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1楼2014-07-18 10:05:44

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时光镇

铁虫 (初入文坛)

应助: 0 (幼儿园)
金币: 44.6
帖子: 23
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虫号: 7301810
注册: 2017-10-15
性别: MM
专业: 环境微生物学

送红花一朵

引用回帖:

14楼: Originally posted by ninglihua at 2014-07-24 09:33:32
恩，谢谢啦。我连上了！在加连接酶之前我热激了一下，使大片段的超螺旋结构解开，再加酶连接。长菌了。...

请问你当时热激温度是多少，我最近也在做大片段连接，也是连接不上，涂板不长菌，感受态验证过没问题，我的目的片段大概在7kb左右，载体是PUC118线性载体（大概3.1kb）

20楼2022-04-11 11:11:46

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