| 查看: 5338 | 回复: 24 | ||
[求助]
目的片段和载体连接一直不上 已有7人参与
|
||
|
1、目的片段738bp（两端带酶切位点）,载体选择pCAMBIA3301,酶切位点选择Nco I和BstE II。载体确定已经双酶切开来，目的片段应该也双酶切成功（电泳图片看不出来）。用的Promega的T4连接酶，载体和目的片段摩尔比1:5，反应体系20ul，22℃连接3.5小时，转化至DH5α，未出现菌落。 2、也有说将目的片段和T载体先连接，然后再和表达载体连接，这样更容易连上。原理是什么，不懂。 感谢您的帮助。 |
回复此楼» 猜你喜欢
解密度鲁特韦——新一代HIV整合酶抑制剂的化学、药理与产业化图景
已经有0人回复
-
左炔诺孕酮从沃氏氧化物到炔基化反应的工艺迭代与靶点解析
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有157人回复
-
“关闭瘙痒信号”的多肽地非法林醋酸盐全解析
已经有1人回复
-
Tosylate-DPA-714介导¹⁸F-DPA-714 PET成像的前沿进展
已经有0人回复
-
I-BRD9: BRD9溴结构域化学探针，BET选择性>700倍
已经有0人回复
-
莫那利珠单抗阻断NKG2A/HLA-E抑制通路 | Biochempartner
已经有0人回复
-
GSPT1口服分子胶降解剂MRT-2359 | Biochempartner
已经有0人回复
-
碳青霉烯类抗生素为何需联用西司他丁钠？ | Biochempartner
已经有0人回复
-
源自蕨类植物的抗炎美白活性分子去甲氧基荚果蕨素 | Biochempartner
已经有0人回复
-
肠道里的"代谢开关"：Fexaramine用肠道限制性重新定义 FXR 激动剂
已经有0人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 【酶连】三片段连接总是做不出来，求助！
已经有7人回复
- 载体与片段连不上
已经有13人回复
- 目的基因与载体连接问题
已经有8人回复
- T载体连接不上去
已经有26人回复
- 片段总是连不到T载体上
已经有22人回复
- DNA片段连接到载体上都有什么方法
已经有6人回复
- 目的片段和T载体连接后PCR条带诡异
已经有16人回复
- 确定连接时载体，片段的加入量
已经有4人回复
- 全式金的pEASY-EI载体和目的基因连不上
已经有10人回复
- PCR片段与载体连接不上
已经有6人回复
- 长片段连接问题
已经有12人回复
- 目的片段与载体连接后无法检测出
已经有7人回复
- 关于连接转化载体和片段的问题
已经有6人回复
- PMD19-T载体连接不上428bp的片段
已经有20人回复
- 载体总是连不上，已经一个月了~真心求助，详细在帖子里
已经有7人回复
- 构建pBI121表达载体，目的基因与载体连接不上
已经有54人回复
- 目的片段与表达载体的连接
已经有23人回复
- T载体连接目的片段后做蓝白斑全都是假阳性
已经有6人回复
- 载体连接pcr片段一直连不上
已经有17人回复
- 目的片段和T1载体连接后转入感受态细胞涂板子总不长菌……
已经有7人回复
- 长片段DNA如何连接载体
已经有21人回复
- 【求助/交流】质粒跟目的基因连接不上怎么办
已经有17人回复
- 【求助/交流】为什么我的PCR产物总是连接不上T载体
已经有26人回复
- 【求助/交流】目的片段与载体连接不上
已经有16人回复
lingsheshidu
金虫 (小有名气)
- 应助: 16 (小学生)
- 金币: 771.5
- 散金: 794
- 红花: 2
- 帖子: 128
- 在线: 160.7小时
- 虫号: 2405268
- 注册: 2013-04-07
- 性别: GG
- 专业: 生物化学
【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
赵晓楠zxn(gyesang代发): 金币+3, 鼓励回帖交流！ 2014-04-13 18:28:20
赵晓楠zxn: 金币+4, ★★★很有帮助 2014-04-14 21:27:35
赵晓楠zxn: 金币+1, ★有帮助 2014-04-14 21:31:09
感谢参与，应助指数 +1
赵晓楠zxn(gyesang代发): 金币+3, 鼓励回帖交流！ 2014-04-13 18:28:20
赵晓楠zxn: 金币+4, ★★★很有帮助 2014-04-14 21:27:35
赵晓楠zxn: 金币+1, ★有帮助 2014-04-14 21:31:09
| 载体构建连接不上，许多时候是载体片段和目的基因片段有问题，既然你给出了mol比例，说明你对于载体片段和目的基因片段的量是经过测算的，因此问题可能出在酶切/连接环节。你的基因片段是否酶切开了呢？这个问题是与你的第二个问题相关的，之所以有人建议你先连接T载体，是因为PCR产物连接T载体效率相对较高（须用可在PCR产物末端可加A的PCR聚合酶），提取质粒以后再用Nco I和BstE II酶切质粒（此处为关键：酶切质粒的效率一般要远大于酶切PCR产物），回收带粘末端的基因片段再与载体相连。不知你PCR引物设计时，酶切位点外侧是否加了保护碱基呢？如果引物末端只加了酶切位点，而外侧没有加保护碱基，PCR产物是酶切不开的！也就不可能连接上，只能先连接T载体了。 |
7楼2014-04-13 02:27:30
for5
木虫 (正式写手)
- 应助: 127 (高中生)
- 金币: 3356.6
- 红花: 10
- 帖子: 880
- 在线: 283.6小时
- 虫号: 696070
- 注册: 2009-02-04
- 性别: GG
- 专业: 微生物生理与生物化学
2楼2014-04-12 20:57:42
double可
金虫 (初入文坛)
- 应助: 13 (小学生)
- 金币: 743.2
- 帖子: 31
- 在线: 15.6小时
- 虫号: 1188182
- 注册: 2011-01-12
- 性别: MM
- 专业: 细胞信号转导
9楼2014-04-14 14:31:12
19楼2014-04-15 09:21:57
Neo2000
木虫 (著名写手)
- 应助: 639 (博士)
- 金币: 8720.2
- 红花: 37
- 帖子: 1700
- 在线: 269.3小时
- 虫号: 322365
- 注册: 2007-03-11
- 专业: 生物物理、生物化学与分子
3楼2014-04-12 22:46:37
淘淘279
铜虫 (小有名气)
- 应助: 9 (幼儿园)
- 金币: 934.8
- 帖子: 64
- 在线: 16.4小时
- 虫号: 2670382
- 注册: 2013-09-22
- 性别: MM
- 专业: 生物大分子结构与功能
4楼2014-04-12 23:06:33
淘淘279
铜虫 (小有名气)
- 应助: 9 (幼儿园)
- 金币: 934.8
- 帖子: 64
- 在线: 16.4小时
- 虫号: 2670382
- 注册: 2013-09-22
- 性别: MM
- 专业: 生物大分子结构与功能
5楼2014-04-12 23:09:51
随风飘摇11
木虫 (著名写手)
- 应助: 92 (初中生)
- 金币: 2284.9
- 散金: 606
- 红花: 53
- 帖子: 2249
- 在线: 818.5小时
- 虫号: 1146270
- 注册: 2010-11-14
- 专业: 生物物理、生物化学与分子
6楼2014-04-12 23:46:09
8楼2014-04-14 14:04:01
zhangtao110
银虫 (小有名气)
- 应助: 4 (幼儿园)
- 金币: 25.3
- 红花: 1
- 帖子: 186
- 在线: 132.2小时
- 虫号: 2364241
- 注册: 2013-03-20
- 专业: 细胞信号转导
10楼2014-04-14 15:20:11