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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 核酸杂交 » 目的片段和载体连接一直不上
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赵晓楠zxn

金虫 (初入文坛)

[求助] 目的片段和载体连接一直不上 已有7人参与

1、目的片段738bp（两端带酶切位点）,载体选择pCAMBIA3301,酶切位点选择Nco I和BstE II。载体确定已经双酶切开来，目的片段应该也双酶切成功（电泳图片看不出来）。用的Promega的T4连接酶，载体和目的片段摩尔比1:5，反应体系20ul，22℃连接3.5小时，转化至DH5α，未出现菌落。
2、也有说将目的片段和T载体先连接，然后再和表达载体连接，这样更容易连上。原理是什么，不懂。
感谢您的帮助。
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在学术的汪洋里，扑腾。
1楼 2014-04-12 20:46:55
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zhangtao110

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
如果酶切位点刚好甲基化可能也切不开!

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10楼2014-04-14 15:20:11
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zhangtao110

银虫 (小有名气)
引用回帖:
16楼: Originally posted by 赵晓楠zxn at 2014-04-14 21:30:18
怎么判断酶切位点甲基化？...

一般基因工程中的大肠杆菌都是甲基化缺陷的，如果正常大肠杆菌会在CCA/TGG序列的胞嘧啶残基甲基化，这样在细胞内就不会被切断了！？而外侵者就会被降解了！所以看你的大肠杆菌和酶切位点了！

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18楼2014-04-14 22:49:32
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