| 查看: 4127 | 回复: 22 | |||
夏天的普洱茶木虫 (著名写手)
|
[求助]
片段总是连不到T载体上
|
||
| 我的片段一个是2000，一个是3000bp，高保真酶扩增出来的，胶回收以后加A，然后和pMD19-T 15度过夜连接，转化到DH5a，感受态是自己做的，蓝白斑都有，挑白斑做单双酶切，全都显示没连上，又做了M13引物扩增，条带在200左右，也表示没连上。来回做了3次，买了新的载体，干脆一个板子上只长1个菌落了。每次转化都有对照，一个是空载体，一般都有一些白斑。一个是control insert，会长一个板子的白斑。一个是只有感受态细胞，什么都不长。实在找不到原因了，请各位帮忙分析。 |
回复此楼» 收录本帖的淘帖专辑推荐
 分子生化实验经验积累 |
» 猜你喜欢
Wnt-C59：PORCN靶向化学探针，Wnt信号通路阻断机制与科研应用全解析
已经有0人回复
-
Fexaramine：肠道限制性FXR化学探针，结构特征与信号通路研究全解析
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有122人回复
-
NVS-STG2：靶向STING跨膜域的分子胶类激动剂，结构特征与寡聚化机制研究全解析
已经有0人回复
-
DOTA-GPC3肽（CAS 3066439-94-6）：双功能分子探针前体的结构特征与标记应用解析
已经有0人回复
-
科研用 TLR7/8 双激动剂怎么选？现货与质控要点
已经有0人回复
-
SEL120-34A HCl：CDK8/CDK19高选择性激酶抑制剂
已经有0人回复
-
氢氧化钾活化操作
已经有18人回复
-
散金
已经有68人回复
-
生物质超级电容器
已经有0人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 片段与载体的连接问题
已经有10人回复
- 目的片段和pMD18-T simple vector 的连接
已经有20人回复
- pcr产物胶回收浓度低，能不能和T载体连接
已经有16人回复
- 载体和酶切片段连接的问题
已经有5人回复
- 2174bp大小的分子片段和PMD18T都连不上，各位帮忙想想办法哦
已经有8人回复
- T载体连接问题
已经有3人回复
- T载体酶切片段与目的片段大小不一致
已经有12人回复
- PMD19-T载体连接不上428bp的片段
已经有20人回复
- 大片段连接问题
已经有20人回复
- 目的片段与表达载体的连接
已经有23人回复
- T载体连接问题
已经有8人回复
- T载体连接目的片段后做蓝白斑全都是假阳性
已经有6人回复
- 载体连接pcr片段一直连不上
已经有17人回复
- 长片段DNA如何连接载体
已经有21人回复
- 兼并引物PCR连T载体后，怎么鉴定有没有连上
已经有20人回复
- 129bp小片段从pGEM-T上酶切回收的问题
已经有13人回复
- 为什么我做的酶切连接总是不长斑呢？
已经有24人回复
- 【求助/交流】质粒跟目的基因连接不上怎么办
已经有17人回复
- 【求助/交流】为什么我的PCR产物总是连接不上T载体
已经有26人回复
- 【求助/交流】PCR产物测序总是不对
已经有13人回复
- 【求助/交流】在线等，片段在T载体上连反了，会不会影响表达
已经有3人回复
- 【求助/交流】请教3000bp的条带的连接问题
已经有15人回复
- 【求助/交流】关于T载体连接问题
已经有22人回复
cynthia8225
新虫 (小有名气)
- 应助: 4 (幼儿园)
- 金币: 210.4
- 散金: 15
- 红花: 1
- 帖子: 98
- 在线: 32.2小时
- 虫号: 1836651
- 注册: 2012-05-27
- 性别: MM
- 专业: 微生物遗传育种学
9楼2013-06-07 22:01:54
dcb005
金虫 (著名写手)
- 应助: 28 (小学生)
- 贵宾: 0.005
- 金币: 1108.8
- 散金: 110
- 红花: 2
- 帖子: 1850
- 在线: 103.1小时
- 虫号: 275937
- 注册: 2006-09-02
- 性别: GG
- 专业: 生物化学
2楼2013-06-07 16:03:21
夏天的普洱茶
木虫 (著名写手)
- 应助: 69 (初中生)
- 金币: 5116.5
- 红花: 18
- 帖子: 1048
- 在线: 441.4小时
- 虫号: 1427657
- 注册: 2011-10-05
- 性别: MM
- 专业: 微生物生理与生物化学
3楼2013-06-07 16:06:49
lmcyjxs
金虫 (正式写手)
- MolEPI: 1
- 应助: 17 (小学生)
- 金币: 1088.2
- 散金: 119
- 红花: 7
- 帖子: 954
- 在线: 124.3小时
- 虫号: 1255578
- 注册: 2011-04-05
- 性别: MM
- 专业: 中药资源
【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
夏天的普洱茶(gyesang代发): 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-06-08 00:05:20
夏天的普洱茶: 金币+2, ★★★★★最佳答案 2013-06-13 09:53:35
感谢参与，应助指数 +1
夏天的普洱茶(gyesang代发): 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-06-08 00:05:20
夏天的普洱茶: 金币+2, ★★★★★最佳答案 2013-06-13 09:53:35
|
你好！我前段时间做了克隆连接，用的是PMD-18T，16℃，10h，一次连上，几乎没有白斑，我做了菌落PCR鉴定，然后直接测序，都证明是连上了。 按我来分析，你的片段用PMD-19T应该是没有问题的，做了阳性对照，如果你的抗生素等没有问题的话，表明感受态细胞应该也没有问题，问题是你的空载体怎么也是白班呢？你的阴性对照不该是空载体转化到感受态细胞涂布的吗？空载体转化的感受态细胞涂布培养的话，应该全是蓝斑。只有感受态细胞，在含抗性的培养基中是不长的。 我自己另外有做水涂布分别涂在含抗性和不含抗性的培养基上做对照，证明操作和抗生素没有问题 总之：1 检查抗生素、底物、诱导剂等有无问题 2 双酶切体系有没问题 3 PMD-19T连接的时间好像不用那么长，你可以咨询下你购买那个公司的技术支持。 4 确定产物加A没有问题？ 5 整个流程中，自己有没有漏了什么步骤、有没有用错什么试剂？有没有加错量？等等细节问题都是很重要的。 不知是否对你有所帮助，仅供交流学习！ |
4楼2013-06-07 16:07:47
夏天的普洱茶
木虫 (著名写手)
- 应助: 69 (初中生)
- 金币: 5116.5
- 红花: 18
- 帖子: 1048
- 在线: 441.4小时
- 虫号: 1427657
- 注册: 2011-10-05
- 性别: MM
- 专业: 微生物生理与生物化学
5楼2013-06-07 16:15:30
lmcyjxs
金虫 (正式写手)
- MolEPI: 1
- 应助: 17 (小学生)
- 金币: 1088.2
- 散金: 119
- 红花: 7
- 帖子: 954
- 在线: 124.3小时
- 虫号: 1255578
- 注册: 2011-04-05
- 性别: MM
- 专业: 中药资源
6楼2013-06-07 17:49:44
夏天的普洱茶
木虫 (著名写手)
- 应助: 69 (初中生)
- 金币: 5116.5
- 红花: 18
- 帖子: 1048
- 在线: 441.4小时
- 虫号: 1427657
- 注册: 2011-10-05
- 性别: MM
- 专业: 微生物生理与生物化学
7楼2013-06-07 18:55:18
8楼2013-06-07 22:01:15
夏天的普洱茶
木虫 (著名写手)
- 应助: 69 (初中生)
- 金币: 5116.5
- 红花: 18
- 帖子: 1048
- 在线: 441.4小时
- 虫号: 1427657
- 注册: 2011-10-05
- 性别: MM
- 专业: 微生物生理与生物化学
10楼2013-06-08 12:59:14
20
