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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 片段总是连不到T载体上
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夏天的普洱茶

木虫 (著名写手)

[求助] 片段总是连不到T载体上

我的片段一个是2000，一个是3000bp，高保真酶扩增出来的，胶回收以后加A，然后和pMD19-T 15度过夜连接，转化到DH5a，感受态是自己做的，蓝白斑都有，挑白斑做单双酶切，全都显示没连上，又做了M13引物扩增，条带在200左右，也表示没连上。来回做了3次，买了新的载体，干脆一个板子上只长1个菌落了。每次转化都有对照，一个是空载体，一般都有一些白斑。一个是control insert，会长一个板子的白斑。一个是只有感受态细胞，什么都不长。实在找不到原因了，请各位帮忙分析。
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1楼2013-06-07 15:28:11
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

cynthia8225

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
夏天的普洱茶(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-06-08 00:05:38
我觉得是A尾没加好。。。你可以用高保真PCR结束后直接加taq在72℃保持30min加尾。。。。还有可能你是用高保真PCR出了条带，但是可能不是你的条带（这个你可以直接测序PCR产物），再说了你要是两端有酶切位点的话就直接酶切连目标载体好了。。。实在不行还有平末端载体。。。你可以尝试用用看，这样就与加尾无关了。。。。
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9楼2013-06-07 22:01:54
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dcb005

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
夏天的普洱茶(gyesang代发): 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-06-08 00:05:04
估计还是A尾巴没加上的原因，有A尾巴很好连，给2条建议：
1. 用另一种直接扩展出A尾巴的酶，因为你的片段不是很大，普通的taq都能满足要求，不产生错配
2. 换blunt末端载体，pJET1.2
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★穷则独善其身,达则兼济天下★
2楼2013-06-07 16:03:21
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夏天的普洱茶

木虫 (著名写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by dcb005 at 2013-06-07 16:03:21
估计还是A尾巴没加上的原因，有A尾巴很好连，给2条建议：
1. 用另一种直接扩展出A尾巴的酶，因为你的片段不是很大，普通的taq都能满足要求，不产生错配
2. 换blunt末端载体，pJET1.2

我的片段是未知的，用普通的taq酶扩了一个月都没出来，后来换了高保真才出来的
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3楼2013-06-07 16:06:49
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lmcyjxs

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
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夏天的普洱茶(gyesang代发): 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-06-08 00:05:20
夏天的普洱茶: 金币+2, ★★★★★最佳答案 2013-06-13 09:53:35
你好！我前段时间做了克隆连接，用的是PMD-18T，16℃，10h，一次连上，几乎没有白斑，我做了菌落PCR鉴定，然后直接测序，都证明是连上了。
按我来分析，你的片段用PMD-19T应该是没有问题的，做了阳性对照，如果你的抗生素等没有问题的话，表明感受态细胞应该也没有问题，问题是你的空载体怎么也是白班呢？你的阴性对照不该是空载体转化到感受态细胞涂布的吗？空载体转化的感受态细胞涂布培养的话，应该全是蓝斑。只有感受态细胞，在含抗性的培养基中是不长的。
我自己另外有做水涂布分别涂在含抗性和不含抗性的培养基上做对照，证明操作和抗生素没有问题

总之：1 检查抗生素、底物、诱导剂等有无问题
      2 双酶切体系有没问题
      3 PMD-19T连接的时间好像不用那么长，你可以咨询下你购买那个公司的技术支持。
      4 确定产物加A没有问题？
      5 整个流程中，自己有没有漏了什么步骤、有没有用错什么试剂？有没有加错量？等等细节问题都是很重要的。

   不知是否对你有所帮助，仅供交流学习！
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思路决定出路。。。
4楼2013-06-07 16:07:47
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夏天的普洱茶

木虫 (著名写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by lmcyjxs at 2013-06-07 16:07:47
你好！我前段时间做了克隆连接，用的是PMD-18T，16℃，10h，一次连上，几乎没有白斑，我做了菌落PCR鉴定，然后直接测序，都证明是连上了。
按我来分析，你的片段用PMD-19T应该是没有问题的，做了阳性对照，如果你的 ...

谢谢，你分析的很详细。我也搞不懂我用空载体转化到感受态里面为什么有很多白斑。我用感受态涂了平板，没长，证明抗生素没问题吧。现在我就不确定加A这一步，是不是没有办法验证A尾巴有没有加上去？
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5楼2013-06-07 16:15:30
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lmcyjxs

金虫 (正式写手)
★
夏天的普洱茶(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-06-08 00:05:30
引用回帖:
5楼: Originally posted by 夏天的普洱茶 at 2013-06-07 16:15:30
谢谢，你分析的很详细。我也搞不懂我用空载体转化到感受态里面为什么有很多白斑。我用感受态涂了平板，没长，证明抗生素没问题吧。现在我就不确定加A这一步，是不是没有办法验证A尾巴有没有加上去？...

这个测序就知道了吧，但是比较麻烦，应该还有其他方法，这个我不是很清楚，你可以再搜索下相关资料。。。
不过我觉得，你将自己的产物稀释100倍左右（根据自己原PCR产物的量计算大概稀释倍数），再用原来的引物及普通Taq酶就可以加A尾，连接效率应该很高的。你或许可以试试，只是这样的话，可能会产生一些碱基突变，不确定。
你的空载体转化到感受态就有白斑，我是怀疑是不是你的载体有污染了？换成其他载体也这样吗？每次空载体都有白斑？
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思路决定出路。。。
6楼2013-06-07 17:49:44
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夏天的普洱茶

木虫 (著名写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by lmcyjxs at 2013-06-07 17:49:44
这个测序就知道了吧，但是比较麻烦，应该还有其他方法，这个我不是很清楚，你可以再搜索下相关资料。。。
不过我觉得，你将自己的产物稀释100倍左右（根据自己原PCR产物的量计算大概稀释倍数），再用原来的引物及 ...

载体是新买的，takara的，每次都会有白斑
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7楼2013-06-07 18:55:18
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taojun

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

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我的连接是16度过夜啊！
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8楼2013-06-07 22:01:15
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夏天的普洱茶

木虫 (著名写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by taojun at 2013-06-07 22:01:15
我的连接是16度过夜啊！

实验室没有16度的培养箱，我就用15度了，这个应该影响不大吧
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10楼2013-06-08 12:59:14
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