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夏天的普洱茶

木虫 (著名写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by cynthia8225 at 2013-06-07 22:01:54
我觉得是A尾没加好。。。你可以用高保真PCR结束后直接加taq在72℃保持30min加尾。。。。还有可能你是用高保真PCR出了条带，但是可能不是你的条带（这个你可以直接测序PCR产物），再说了你要是两端有酶切位点的话就直 ...

我P出来的条带不是很单一，得切胶回收，所以得在切胶回收后才能加A。
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11楼2013-06-08 13:00:02
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实心小白菜

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
我记得有的高保真酶是加尾的，有的是不加尾巴的，如果酶本身能加尾巴，应该就挺容易的，你看那个那么便宜的taq酶只要P出来连T载体都没问题
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有啥不高兴的事儿，说出来大家乐呵乐呵~
12楼2013-06-08 17:28:51
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你实在找不出原因就从酶试剂上找。用酶时要是酶处于最适状态，另外商用酶试剂一般都加有甘油，使用酶量较大或者试剂多，甘油对于酶的影响会更明显。你最好使用前用超滤或者透析适当去除甘油。
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13楼2013-06-08 18:53:58
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夏天的普洱茶

木虫 (著名写手)
引用回帖:
12楼: Originally posted by 实心小白菜 at 2013-06-08 17:28:51
我记得有的高保真酶是加尾的，有的是不加尾巴的，如果酶本身能加尾巴，应该就挺容易的，你看那个那么便宜的taq酶只要P出来连T载体都没问题

我的酶是要自己加A的，说明书上写了，谢谢
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14楼2013-06-08 21:28:13
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夏天的普洱茶

木虫 (著名写手)
引用回帖:
13楼: Originally posted by 凌波丽 at 2013-06-08 18:53:58
你实在找不出原因就从酶试剂上找。用酶时要是酶处于最适状态，另外商用酶试剂一般都加有甘油，使用酶量较大或者试剂多，甘油对于酶的影响会更明显。你最好使用前用超滤或者透析适当去除甘油。

谢谢
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15楼2013-06-08 21:28:20
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fuding6

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
我觉得你可以试一下高保真又带A的酶，比如全式金的HiFi酶。
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16楼2013-06-08 22:00:14
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ccharlien

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
高保真酶扩完后直接在体系中加入普通taq酶（0.5ul就够了）72度保温十分钟然后再割胶回收做连接
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17楼2013-06-08 23:33:53
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夏天的普洱茶

木虫 (著名写手)
引用回帖:
17楼: Originally posted by ccharlien at 2013-06-08 23:33:53
高保真酶扩完后直接在体系中加入普通taq酶（0.5ul就够了）72度保温十分钟然后再割胶回收做连接

谢谢，这样的效果是不是比胶回收以后再加A要好？
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18楼2013-06-09 08:19:58
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夏天的普洱茶

木虫 (著名写手)
引用回帖:
16楼: Originally posted by fuding6 at 2013-06-08 22:00:14
我觉得你可以试一下高保真又带A的酶，比如全式金的HiFi酶。

谢谢，我试过好几种高保真酶，只有现在用的这个效果最好。
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19楼2013-06-09 08:20:34
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ccharlien

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
18楼: Originally posted by 夏天的普洱茶 at 2013-06-09 08:19:58
谢谢，这样的效果是不是比胶回收以后再加A要好？...

我觉得会好很多，不会在加A之前就经历一次割胶回收的产物损失，而且不用组配两次PCR体系，这样操作TA克隆还没失败过
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20楼2013-06-09 16:28:20
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