应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 片段与载体的连接问题
111/2返回列表12下一页
查看: 1630  |  回复: 10
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

Yocan2012

新虫 (小有名气)

[求助] 片段与载体的连接问题

本人自己构建了一个8863bp大小的载体，想要将1900bp大小的目的基因连接到该载体上，使用的内切酶是SmaI/NotI。一开始很容易就连上了，1个月后再进行连接的时候，却在也连不上了。酶切没有问题；连接酶用的是Takara公司的Solution I，应该也没有问题，因为用它连接T载体的效率比较高。
用T载体上面切下来的片段进行连接后，会出现较多连接到T上面的假阳性；如果用PCR产物直接酶切后连接的话，在选择性平板上没有菌落生长。
求高人或者有过同样遭遇的虫友指点。
回复此楼

» 收录本帖的淘帖专辑推荐

分子生化实验经验积累

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2013-01-18 17:40:52
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
"用T载体上面切下来的片段进行连接后，会出现较多连接到T上面的假阳性"
不明白这是什么意思。你把片段从T载体切下来后不回收片段的吗？为什么还会有连到T载体上的假阳性？
PCR产物做酶切连接没有的话可能是PCR产物酶切不完全。NotI需要6个保护碱基切过夜。
还有，不知道你开始既然很容易连上了，为什么1个月后还要再连呢？
赞一下(1人) 回复此楼
2楼2013-01-19 08:32:58
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通回帖

Yocan2012

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-01-19 08:32:58
"用T载体上面切下来的片段进行连接后，会出现较多连接到T上面的假阳性"
不明白这是什么意思。你把片段从T载体切下来后不回收片段的吗？为什么还会有连到T载体上的假阳性？
PCR产物做酶切连接没有的话可 ...

是从T载体上面切下来的，完全分开后做胶回收，而且回收后的条带很单一。
酶切不完全有可能，但是8个平板一个菌落都不长就不至于了吧？
和一个月前连接的是相同大小的不同基因，而且用的酶切位点是一样的。
赞一下 回复此楼
3楼2013-01-19 11:10:35
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by Yocan2012 at 2013-01-19 11:10:35
是从T载体上面切下来的，完全分开后做胶回收，而且回收后的条带很单一。
酶切不完全有可能，但是8个平板一个菌落都不长就不至于了吧？
和一个月前连接的是相同大小的不同基因，而且用的酶切位点是一样的。...

既然你的目的片段是从T载体切下来胶回收的，应该是没什么问题。连接的时候是否做了只有载体不加目的片段的对照？如果这个对照上长很多克隆，说明载体酶切不好。可以从新酶切载体。什么的都不长虽然是理论上的结果，但一般情况下酶切不可能100%，还是会有少许克隆的。如果真的什么都不长，可能是连接酶有问题或者转化失败。
赞一下 回复此楼
4楼2013-01-19 12:12:31
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

loveerobin

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
可以用第一个基因连接载体的质粒进行酶切，回收后与第二个基因连接。
也可以尝试用T4连接酶代替Solution1进行连接。
赞一下 回复此楼
5楼2013-01-19 13:19:50
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Yocan2012

新虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by loveerobin at 2013-01-19 13:19:50
可以用第一个基因连接载体的质粒进行酶切，回收后与第二个基因连接。
也可以尝试用T4连接酶代替Solution1进行连接。

是的，用的就是连接有第一个基因的载体，所以才说酶切没有问题的，因为可以明确看到是切开的。
赞一下 回复此楼
6楼2013-01-19 15:24:26
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

loveerobin

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
6楼: Originally posted by Yocan2012 at 2013-01-19 15:24:26
是的，用的就是连接有第一个基因的载体，所以才说酶切没有问题的，因为可以明确看到是切开的。...

酶切回收产物跑电泳检测了吗？
那就再做一次转化吧
赞一下 回复此楼
7楼2013-01-19 16:22:57
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Yocan2012

新虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by loveerobin at 2013-01-19 16:22:57
酶切回收产物跑电泳检测了吗？
那就再做一次转化吧...

载体和片段回收后的电泳条带都很亮很单一。
已经做了无数次了，发现每个环节似乎都没有问题，但就是不出结果。
赞一下 回复此楼
8楼2013-01-19 22:56:43
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

loveerobin

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
8楼: Originally posted by Yocan2012 at 2013-01-19 22:56:43
载体和片段回收后的电泳条带都很亮很单一。
已经做了无数次了，发现每个环节似乎都没有问题，但就是不出结果。...

那就是感受态和板子的问题了
借别人的感受态用用
如果一样的话，大概是自己的板子时间太久了或者抗生素需要重新配制了
赞一下 回复此楼
9楼2013-01-20 12:17:05
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Yocan2012

新虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by loveerobin at 2013-01-20 12:17:05
那就是感受态和板子的问题了
借别人的感受态用用
如果一样的话，大概是自己的板子时间太久了或者抗生素需要重新配制了...

我想问，你们做连接用的质粒都是当天提取、酶切、回收、连接的么？我有时候会用放了一段时间的质粒来做连接。
赞一下 回复此楼
10楼2013-01-20 16:45:59
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 Yocan2012 的主题更新
111/2返回列表12下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] 我面上完蛋了 +9 且听虎啸 2026-08-20 10/500 2026-08-24 20:08 by 苦寒来香
[基金申请] 能否退出参与的面上项目解除限项 +21 koalala 2026-08-24 24/1200 2026-08-24 19:25 by 家与远方
[基金申请] filecode，4个jtjc了 +14 ziyangfang 2026-08-19 17/850 2026-08-24 18:37 by 哈哈蛤？
[基金申请] 人气不行了 +9 fansofjerry 2026-08-21 9/450 2026-08-24 17:48 by zhaozhengxin
[基金申请] 没有任何消息-是不是就凉了 +6 图啦图啦 2026-08-24 6/300 2026-08-24 17:44 by 小小红帆
[基金申请] 今日不放榜？网传国自然预计 8 月 27 日可查结果 +17 医学老男孩 2026-08-20 21/1050 2026-08-24 14:21 by refreshing11
[基金申请] 范进中举一文的中心思想 +6 炎黄贵胄 2026-08-22 7/350 2026-08-24 11:58 by 6543yes
[基金申请] 让我中一个面上吧！ +13 大萍1987 2026-08-20 16/800 2026-08-24 10:23 by 太傻了
[基金申请] 放榜前的不淡定 20+4 snowwithsea 2026-08-19 17/850 2026-08-24 10:20 by echo8914667
[基金申请] 明天应该可查了！？ +4 chengyan1220 2026-08-23 4/200 2026-08-24 08:47 by gloomy6159
[教师之家] 跳槽后在研项目怎么办？ +5 简单化xn 2026-08-22 10/500 2026-08-23 12:38 by 简单化xn
[基金申请] 今天基金会出结果吗？20260819 +16 kkkl_v 2026-08-19 17/850 2026-08-22 16:12 by 阿布Abu
[基金申请] 时间戳今天，20号变了 +5 archvillain 2026-08-20 5/250 2026-08-22 06:12 by hui_daxiao
[基金申请] 看来今天不会放榜了？ +8 chengyan1220 2026-08-21 11/550 2026-08-21 17:52 by dcqxinyang
[基金申请] 时间戳又变了 +13 wuchongjun 2026-08-20 19/950 2026-08-21 17:21 by 紫杉醇
[基金申请] 应该是下周三26日公布了吧？ +4 哈哈蛤？ 2026-08-21 4/200 2026-08-21 10:58 by Vivilian
[论文投稿] 投稿咨询 +5 wwm09 2026-08-17 7/350 2026-08-21 10:11 by 期刊论文帮手
[基金申请] 今天放榜没戏了吧 +9 yuleib84 2026-08-19 11/550 2026-08-21 10:06 by gltch
[基金申请] 基金啊基金 +4 longfie172 2026-08-20 4/200 2026-08-21 08:58 by mark mao
[基金申请] 明天放榜？ +5 Shxjjxjkx 2026-08-18 5/250 2026-08-18 18:14 by -大大大大大-
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭