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Yocan2012

新虫 (小有名气)

[求助] 片段与载体的连接问题

本人自己构建了一个8863bp大小的载体,想要将1900bp大小的目的基因连接到该载体上,使用的内切酶是SmaI/NotI。一开始很容易就连上了,1个月后再进行连接的时候,却在也连不上了。酶切没有问题;连接酶用的是Takara公司的Solution I,应该也没有问题,因为用它连接T载体的效率比较高。
用T载体上面切下来的片段进行连接后,会出现较多连接到T上面的假阳性;如果用PCR产物直接酶切后连接的话,在选择性平板上没有菌落生长。
求高人或者有过同样遭遇的虫友指点。
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Yocan2012

新虫 (小有名气)

引用回帖:
7楼: Originally posted by loveerobin at 2013-01-19 16:22:57
酶切回收产物跑电泳检测了吗?
那就再做一次转化吧...

载体和片段回收后的电泳条带都很亮很单一。
已经做了无数次了,发现每个环节似乎都没有问题,但就是不出结果。
8楼2013-01-19 22:56:43
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
"用T载体上面切下来的片段进行连接后,会出现较多连接到T上面的假阳性"
不明白这是什么意思。你把片段从T载体切下来后不回收片段的吗?为什么还会有连到T载体上的假阳性?
PCR产物做酶切连接没有的话可能是PCR产物酶切不完全。NotI需要6个保护碱基切过夜。
还有,不知道你开始既然很容易连上了,为什么1个月后还要再连呢?
2楼2013-01-19 08:32:58
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Yocan2012

新虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-01-19 08:32:58
"用T载体上面切下来的片段进行连接后,会出现较多连接到T上面的假阳性"
不明白这是什么意思。你把片段从T载体切下来后不回收片段的吗?为什么还会有连到T载体上的假阳性?
PCR产物做酶切连接没有的话可 ...

是从T载体上面切下来的,完全分开后做胶回收,而且回收后的条带很单一。
酶切不完全有可能,但是8个平板一个菌落都不长就不至于了吧?
和一个月前连接的是相同大小的不同基因,而且用的酶切位点是一样的。
3楼2013-01-19 11:10:35
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by Yocan2012 at 2013-01-19 11:10:35
是从T载体上面切下来的,完全分开后做胶回收,而且回收后的条带很单一。
酶切不完全有可能,但是8个平板一个菌落都不长就不至于了吧?
和一个月前连接的是相同大小的不同基因,而且用的酶切位点是一样的。...

既然你的目的片段是从T载体切下来胶回收的,应该是没什么问题。连接的时候是否做了只有载体不加目的片段的对照?如果这个对照上长很多克隆,说明载体酶切不好。可以从新酶切载体。什么的都不长虽然是理论上的结果,但一般情况下酶切不可能100%,还是会有少许克隆的。如果真的什么都不长,可能是连接酶有问题或者转化失败。
4楼2013-01-19 12:12:31
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