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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 关于连接转化载体和片段的问题
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a13515517892

木虫 (小有名气)

[求助] 关于连接转化载体和片段的问题

关于连接转化载体和片段的问题：做了一段时间的连接转化，一直有个问题困扰着我，就是在连接转化的时候看了很多的资料都说载体和片段的比例在1：3比较合适，我就想问，载体的浓度是说在质粒酶切之后胶回收的浓度的还是酶切之前的原始质粒浓度。
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1楼 2012-06-27 09:55:55
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陈朵朵

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
是指的回收之后的浓度，载体与片段浓度之比在1：3-1：10都行，影响不太大。
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2楼2012-06-27 10:10:10
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太极拳

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-06-27 13:41:50
这个比例指的是你的目的片段（待连接到载体上的片段）与载体的浓度，或者说可以是分子数的比值。楼上说的范围都可以，1：3-1：10，视情况而定。
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3楼2012-06-27 10:20:18
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a13515517892

木虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 太极拳 at 2012-06-27 10:20:18
这个比例指的是你的目的片段（待连接到载体上的片段）与载体的浓度，或者说可以是分子数的比值。楼上说的范围都可以，1：3-1：10，视情况而定。

那请问载体大概在7000bp的，片段大概在2000bp做10ul的体系，比例还怎么加啊，是按照1：3计算加么，我用那个微量分光光度计测定的载体浓度大概在15ng/ul，片段的浓度大概在60左右，请帮我详细计算一下，谢谢
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4楼2012-06-28 01:13:50
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a13515517892

木虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 陈朵朵 at 2012-06-27 10:10:10
是指的回收之后的浓度，载体与片段浓度之比在1：3-1：10都行，影响不太大。

那请问载体大概在7000bp的，片段大概在2000bp做10ul的体系，比例还怎么加啊，是按照1：3计算加么，我用那个微量分光光度计测定的载体浓度大概在15ng/ul，片段的浓度大概在60左右，请帮我详细计算一下，谢谢
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5楼2012-06-28 01:14:02
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陈朵朵

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by a13515517892 at 2012-06-28 01:14:02
那请问载体大概在7000bp的，片段大概在2000bp做10ul的体系，比例还怎么加啊，是按照1：3计算加么，我用那个微量分光光度计测定的载体浓度大概在15ng/ul，片段的浓度大概在60左右，请帮我详细计算一下，谢谢...

1:3是摩尔比，根据DNA的质量与摩尔换算公式(xxx ug*10e6)/(660pg*bp数）=xxx pmol       所以 计算后 DNA与载体的摩尔浓度比为1：1.14。 所以10ul 体系  你可以DNA片段 加 6ul， 载体2ul 或者1ul ， T4连接酶 1ul， buffer 1ul ， ddH2O补齐10ul  。或者按照说明书上不加T4连接酶 直接加 Solution 。  如有错误 欢迎纠正~~
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6楼2012-06-28 11:13:02
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sk_yb

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
这个比例只是一个参考。不用严格按着这个比例执行。根据载体和片段浓度自行调整。不用太严格的
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7楼2012-06-28 11:17:26
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