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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 关于pMD19-T载体连接转化问题
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转基因猴子

木虫 (正式写手)

[求助] 关于pMD19-T载体连接转化问题 已有4人参与

我PCR获得了我的目的基因片段，切胶回收后条带很纯很亮。之后我连接takara公司的pMD19-T simple vector，但是一直连接不上去。AMP是新配的，新倒的平板。怕自己做的感受态效率低，买的takara公司的DH5α感受态，按照其说明书上进行的转化。连接体系也是按照的说明书进行的。为什么一直是平板空空如也，神马也没有呢？重复好几次了！请教各位如何改进？
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我还年轻，我要上路！
1楼 2014-05-08 08:09:57
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Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2014-05-08 12:14:01
你可以转个质粒试试，amp抗性的，检查下转化这套有问题没？

[ 发自小木虫客户端 ]
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2楼2014-05-08 08:15:01
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转基因猴子

木虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by Neo2000 at 2014-05-08 08:15:01
你可以转个质粒试试，amp抗性的，检查下转化这套有问题没？

是的，我尝试下。去年我做的时候很顺利，这套系统也很成熟。做一个成一个。然后隔了一段时间没做，今年就出现一直连不出来。如果对照长得很好，那可能是什么原因呢？
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我还年轻，我要上路！
3楼2014-05-08 08:24:24
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liutonglu

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2014-05-08 12:14:06
你用的是不是高保真酶？一般高保真产生平末端，要加一个加A的步骤才能进行连接。
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4楼2014-05-08 09:49:00
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youlinglyw

荣誉版主 (著名写手)

一匡天下

优秀版主

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+4, 鼓励交流 2014-05-08 12:14:12
转基因猴子: 金币+4 2014-05-28 11:21:06
根据你描述，你对这套系统很熟，那么现在这种情况下
可能会出现以下原因
1 PCR问题，你的PCR结果是否确信加上了A
2 你的纯化柱子是不是买了很久了？
3 你是买的dh5α感受态细胞呢还是这个菌株然后自己制作感受态？
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天行健
5楼2014-05-08 10:06:10
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wpwupingwp

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+4, 鼓励交流 2014-05-08 12:14:17
转基因猴子: 金币+4 2014-05-28 11:21:01
1.用的酶有没有poly-A
2.过夜连接试试
3.用Control Vector试试 看是不是感受态细胞的问题
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南无观世音菩萨
6楼2014-05-08 10:37:36
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gzglmn

新虫 (初入文坛)
检测下回收的DNA再进行连接试验吧。
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总有一天我也会变得和你一样强。
7楼2014-06-20 09:04:15
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杨仔儿

木虫 (著名写手)
你的目的基因与载体的量都加多少？
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8楼2015-06-23 16:02:57
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