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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 关于pMD19-T载体连接转化问题
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转基因猴子

木虫 (正式写手)

[求助] 关于pMD19-T载体连接转化问题 已有4人参与

我PCR获得了我的目的基因片段，切胶回收后条带很纯很亮。之后我连接takara公司的pMD19-T simple vector，但是一直连接不上去。AMP是新配的，新倒的平板。怕自己做的感受态效率低，买的takara公司的DH5α感受态，按照其说明书上进行的转化。连接体系也是按照的说明书进行的。为什么一直是平板空空如也，神马也没有呢？重复好几次了！请教各位如何改进？
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我还年轻，我要上路！
1楼 2014-05-08 08:09:57
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gzglmn

新虫 (初入文坛)
检测下回收的DNA再进行连接试验吧。
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总有一天我也会变得和你一样强。
7楼2014-06-20 09:04:15
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Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2014-05-08 12:14:01
你可以转个质粒试试，amp抗性的，检查下转化这套有问题没？

[ 发自小木虫客户端 ]
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2楼2014-05-08 08:15:01
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转基因猴子

木虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by Neo2000 at 2014-05-08 08:15:01
你可以转个质粒试试，amp抗性的，检查下转化这套有问题没？

是的，我尝试下。去年我做的时候很顺利，这套系统也很成熟。做一个成一个。然后隔了一段时间没做，今年就出现一直连不出来。如果对照长得很好，那可能是什么原因呢？
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我还年轻，我要上路！
3楼2014-05-08 08:24:24
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liutonglu

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2014-05-08 12:14:06
你用的是不是高保真酶？一般高保真产生平末端，要加一个加A的步骤才能进行连接。
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4楼2014-05-08 09:49:00
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