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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 关于目的基因不同向连接到T载体上的问题
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nepwisil

禁虫 (小有名气)
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1楼 2013-05-24 23:35:32
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bullfrog325

木虫 (正式写手)
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gyesang: 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-05-30 21:44:16
六个阅读框里都有终止密码子? 这样的话我也想不出为什么连接的时候有方向性了.
在连T载体的时候出现这种情况是很小概率的事件, 生物实验的东东, 如果一百个人用只有两三个人出问题那我们会认为这是个好产品对吧?
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15楼2013-05-28 15:36:39
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
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myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，感谢你的慷慨解囊，期待你的精彩。 2013-05-28 10:33:56
没有遇到过。虽然两个方向插入的比例往往不是1:1的，一般是有一个方向会多一些。你筛了多少克隆？
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2楼2013-05-25 09:10:25
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阿树的秋天

铜虫 (初入文坛)
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myprayer: 金币+1, 感谢你的慷慨解囊，期待你的精彩。 2013-05-28 10:34:04
这个和你挑的有关系吧？T载与目的基因链接没有方向性的 我做的基因GC含量也比较高 但是没有出现楼主的问题
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3楼2013-05-25 09:14:55
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nepwisil

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4楼2013-05-26 10:07:49
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nepwisil

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5楼2013-05-26 10:09:01
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
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引用回帖:
4楼: Originally posted by nepwisil at 2013-05-26 10:07:49
我目前已经筛了53个了...

53个还没有另一个方向的，可能是你这次运气不好，再重新连一下做转化吧。
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6楼2013-05-26 14:21:43
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bonbonzd

木虫 (小有名气)
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myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，感谢你的慷慨解囊，期待你的精彩。 2013-05-28 10:34:27
会不会PCR产物就决定了，只有一个方向，taq酶导致只有3·端为A碱基，而T载体上也只有一端为T。“TA克隆方法（Original TA Cloning Kit）把PCR片断与一个具有3-T突出的载体DNA连接起来的方法。因为PCR反应中所适用的聚合酶具有末端转移的活性，通常在3加上A。例如：Taq聚合酶同时具有的末端连接酶的功能，PCR反应时在每条PCR扩增产物的3端自动添加一个3-A突出端。只有用经过特殊处理的具有3-T突出末端的DNA片断才能通过T/A配对进行连接。”所以，是不是就说TA克隆方法得到的，只能是一个方向的？
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7楼2013-05-27 11:15:32
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bullfrog325

木虫 (正式写手)
★ ★
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myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，感谢你的慷慨解囊，期待你的精彩。 2013-05-28 10:34:32
楼主你这概率已经到1.1e-16了, 我认为不是运气的问题.
是不是你要的那个方向的正好和质粒产生融合蛋白也能形成篮斑?
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8楼2013-05-27 15:26:05
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dcb005

金虫 (著名写手)
★
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试一试用pJET1.2这个blunt-end 的载体，一般两个方向都可以
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★穷则独善其身,达则兼济天下★
9楼2013-05-27 17:36:31
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nepwisil

禁虫 (小有名气)
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10楼2013-05-27 19:02:40
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