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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 崩溃了 难题 跪求解答：质粒提不出，酶切切不开
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囧囧俏

铁虫 (小有名气)

[求助] 崩溃了 难题 跪求解答：质粒提不出，酶切切不开

PCR的目的基因1056bp连接到PMD18-T载体上，之后转入TOP10感受态细胞，酶切鉴定并测序合适后，保甘油菌种。
接下来奇怪的事情发生了：1.大概有两个星期的时间，甘油菌种转接后，试剂盒不能提出质粒：加入2液后菌液不变澄清。
                                         2.因为之前可以提出的时候还有剩余的质粒，所以将它转入TOP10感受态细胞，之后可以提出并能酶切下我的目的基因。可是过了两个月，保的菌种质粒越提越淡，现在已经提不出来了。
                                        3.由于提不出质粒，所以在2中转的平板中，有挑选了一些克隆，PCR鉴定OK，提出质粒后，酶切片段特别淡，无法胶回收。
   
我做了三个不同基因连在T载体，然后都出现了相似的问题，到底是怎么回事呢？连在PMD18-T上的基因不是很稳定吗，该载体也应该很稳定啊，为什么酶切不出基因？之前一直能提出质粒的菌种，为什么都无法提出质粒，有两个菌种能提出质粒，但是酶切后还是特别淡？
一直用的试剂盒提质粒，实验室其它人也在用没有问题，到底问题出在哪了，求神人解答！
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1楼 2012-11-27 11:01:59
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回帖置顶 ( 共有1个 )

囧囧俏

铁虫 (小有名气)
囧囧俏: 回帖置顶 2012-11-28 10:08:59
请问各位，如果之前的AMP按照1:1000加，后来转变为1:100加，这对保的菌种有什么影响？
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12楼2012-11-28 10:06:18
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普通回帖

aoda123

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
我之前提质粒有过提不出来的情况，我的大多原因是摇菌时间过长。在一个就是提质粒的菌液并不需要太多，一般1.5-2毫升，多了反而裂解不开。保存的菌液和质粒时间长了也可能丢失。
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身体健康，工作顺利
2楼2012-11-27 11:38:59
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囧囧俏

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by aoda123 at 2012-11-27 11:38:59
我之前提质粒有过提不出来的情况，我的大多原因是摇菌时间过长。在一个就是提质粒的菌液并不需要太多，一般1.5-2毫升，多了反而裂解不开。保存的菌液和质粒时间长了也可能丢失。

谢谢 这些问题我注意到了 菌液保存的时间不长就是提不出来
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3楼2012-11-27 13:30:01
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weigh1111

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你这加了溶液2都不变清，要么是你溶液2有问题要么就是你菌用太多了~也就是说问题在你提质粒上面
顺便问一句，你保种是什么条件保存的，-20，-70还是4度？
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4楼2012-11-27 14:42:37
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囧囧俏

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by weigh1111 at 2012-11-27 14:42:37
你这加了溶液2都不变清，要么是你溶液2有问题要么就是你菌用太多了~也就是说问题在你提质粒上面
顺便问一句，你保种是什么条件保存的，-20，-70还是4度？

-20
5楼2012-11-27 15:10:04
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jl860822

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
试剂盒坏了吧，我以前也遇到过这种事，其他试剂盒试一下可以，旧的果断扔掉
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6楼2012-11-27 15:33:38
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囧囧俏

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by jl860822 at 2012-11-27 15:33:38
试剂盒坏了吧，我以前也遇到过这种事，其他试剂盒试一下可以，旧的果断扔掉

其他人也在用没有问题，应该是我菌的问题
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7楼2012-11-27 16:09:42
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zhaodahe

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
可能是保菌液出问题了，污染杂菌。建议重新配置，你保的菌在相应抗性平板上再筛选一次吧。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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8楼2012-11-27 18:56:42
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半生一梦

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
是不是你T载体问题啊 我们这边PMD18-T直接买的试剂盒 你要不要重新买个试剂盒儿试试。。。
还有会不会保存菌种的时候哪边操作不当呢 甘油的比例啊神马的。。
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9楼2012-11-27 19:20:59
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囧囧俏

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by zhaodahe at 2012-11-27 18:56:42
可能是保菌液出问题了，污染杂菌。建议重新配置，你保的菌在相应抗性平板上再筛选一次吧。

划过线，提完了还是特别淡的质粒
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10楼2012-11-28 10:02:42
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