应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 崩溃了 难题 跪求解答：质粒提不出，酶切切不开
311/4返回列表1234下一页
查看: 2758  |  回复: 30
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

囧囧俏

铁虫 (小有名气)

[求助] 崩溃了 难题 跪求解答：质粒提不出，酶切切不开

PCR的目的基因1056bp连接到PMD18-T载体上，之后转入TOP10感受态细胞，酶切鉴定并测序合适后，保甘油菌种。
接下来奇怪的事情发生了：1.大概有两个星期的时间，甘油菌种转接后，试剂盒不能提出质粒：加入2液后菌液不变澄清。
                                         2.因为之前可以提出的时候还有剩余的质粒，所以将它转入TOP10感受态细胞，之后可以提出并能酶切下我的目的基因。可是过了两个月，保的菌种质粒越提越淡，现在已经提不出来了。
                                        3.由于提不出质粒，所以在2中转的平板中，有挑选了一些克隆，PCR鉴定OK，提出质粒后，酶切片段特别淡，无法胶回收。
   
我做了三个不同基因连在T载体，然后都出现了相似的问题，到底是怎么回事呢？连在PMD18-T上的基因不是很稳定吗，该载体也应该很稳定啊，为什么酶切不出基因？之前一直能提出质粒的菌种，为什么都无法提出质粒，有两个菌种能提出质粒，但是酶切后还是特别淡？
一直用的试剂盒提质粒，实验室其它人也在用没有问题，到底问题出在哪了，求神人解答！
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)
1楼 2012-11-27 11:01:59
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖置顶 ( 共有1个 )

囧囧俏

铁虫 (小有名气)
囧囧俏: 回帖置顶 2012-11-28 10:08:59
请问各位，如果之前的AMP按照1:1000加，后来转变为1:100加，这对保的菌种有什么影响？
赞一下 回复此楼
12楼2012-11-28 10:06:18
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通回帖

aoda123

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
我之前提质粒有过提不出来的情况，我的大多原因是摇菌时间过长。在一个就是提质粒的菌液并不需要太多，一般1.5-2毫升，多了反而裂解不开。保存的菌液和质粒时间长了也可能丢失。
赞一下 回复此楼
身体健康，工作顺利
2楼2012-11-27 11:38:59
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

囧囧俏

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by aoda123 at 2012-11-27 11:38:59
我之前提质粒有过提不出来的情况，我的大多原因是摇菌时间过长。在一个就是提质粒的菌液并不需要太多，一般1.5-2毫升，多了反而裂解不开。保存的菌液和质粒时间长了也可能丢失。

谢谢 这些问题我注意到了 菌液保存的时间不长就是提不出来
赞一下 回复此楼
3楼2012-11-27 13:30:01
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

weigh1111

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你这加了溶液2都不变清，要么是你溶液2有问题要么就是你菌用太多了~也就是说问题在你提质粒上面
顺便问一句，你保种是什么条件保存的，-20，-70还是4度？
赞一下 回复此楼
4楼2012-11-27 14:42:37
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

囧囧俏

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by weigh1111 at 2012-11-27 14:42:37
你这加了溶液2都不变清，要么是你溶液2有问题要么就是你菌用太多了~也就是说问题在你提质粒上面
顺便问一句，你保种是什么条件保存的，-20，-70还是4度？

-20
5楼2012-11-27 15:10:04
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

jl860822

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
试剂盒坏了吧，我以前也遇到过这种事，其他试剂盒试一下可以，旧的果断扔掉
赞一下 回复此楼
6楼2012-11-27 15:33:38
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

囧囧俏

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by jl860822 at 2012-11-27 15:33:38
试剂盒坏了吧，我以前也遇到过这种事，其他试剂盒试一下可以，旧的果断扔掉

其他人也在用没有问题，应该是我菌的问题
赞一下 回复此楼
7楼2012-11-27 16:09:42
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zhaodahe

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
可能是保菌液出问题了，污染杂菌。建议重新配置，你保的菌在相应抗性平板上再筛选一次吧。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
赞一下 回复此楼
8楼2012-11-27 18:56:42
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

半生一梦

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
是不是你T载体问题啊 我们这边PMD18-T直接买的试剂盒 你要不要重新买个试剂盒儿试试。。。
还有会不会保存菌种的时候哪边操作不当呢 甘油的比例啊神马的。。
赞一下 回复此楼
9楼2012-11-27 19:20:59
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

囧囧俏

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by zhaodahe at 2012-11-27 18:56:42
可能是保菌液出问题了，污染杂菌。建议重新配置，你保的菌在相应抗性平板上再筛选一次吧。

划过线，提完了还是特别淡的质粒
赞一下 回复此楼
10楼2012-11-28 10:02:42
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 囧囧俏 的主题更新
311/4返回列表1234下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] 估计是周四 +3 archvillain 2026-08-18 3/150 2026-08-21 01:48 by jnhyjjm
[基金申请] 科研孤儿太难了 +14 我4大白菜 2026-08-20 15/750 2026-08-20 22:33 by 袁向阳007
[基金申请] 让我中一个面上吧！ +8 大萍1987 2026-08-20 10/500 2026-08-20 21:48 by 大萍1987
[基金申请] 言之凿凿，明天官网会通知放榜？ +15 医学老男孩 2026-08-20 17/850 2026-08-20 20:35 by CaoLG
[基金申请] 今天系统多次维护，明天很可能放榜！ +10 zju2000 2026-08-16 11/550 2026-08-20 20:02 by cl479861084
[基金申请] 时间戳变了，能看出什么问题？ +18 基诺咪客 2026-08-17 23/1150 2026-08-20 17:19 by Godzela
[基金申请] 只有每年这种时候来逛逛小木虫 +21 yaoyewhu2008 2026-08-20 22/1100 2026-08-20 17:03 by yaoyewhu2008
[基金申请] 放榜前的不淡定 40+3 snowwithsea 2026-08-19 12/600 2026-08-20 15:56 by lfy8008
[基金申请] 重要消息，中午系统在维护 +11 yuleib84 2026-08-18 12/600 2026-08-20 11:09 by xskun
[基金申请] 今天基金会出结果吗？20260819 +14 kkkl_v 2026-08-19 15/750 2026-08-20 08:21 by sunzitan
[教师之家] 为什么余额宝的年化利率越来越低？主要原因有哪些？ +5 瞬息宇宙 2026-08-15 5/250 2026-08-19 20:23 by super2002521
[基金申请] 今天放榜吗？ +14 布布和一二 2026-08-19 15/750 2026-08-19 18:07 by gltch
[基金申请] filecode=后面第一个是大写字母 +10 wangze12014 2026-08-14 12/600 2026-08-19 16:56 by 苦难博士
[基金申请] 2027广东省杰青 +4 奶牛小黑 2026-08-15 10/500 2026-08-19 11:02 by wanfengnew
[基金申请] 朋友圈看到的 +6 wangzilk 2026-08-18 8/400 2026-08-19 10:55 by Haru815
[基金申请] 快农历七夕节了，轻松一下，男人悄悄话，女施主请不要进来。 +6 Tide man 2026-08-14 7/350 2026-08-19 09:56 by ZJTJZ
[基金申请] 今天维护系统维护 祝所有人 高中 +8 gjjjzhong 2026-08-18 9/450 2026-08-18 13:01 by 家与远方
[基金申请] 93BebMhtakh前后11位开头都是大写 +4 且听虎啸 2026-08-17 5/250 2026-08-18 00:49 by 蔡棒棒菂
[基金申请] 感觉是下周放榜了 +6 angus9576 2026-08-17 11/550 2026-08-17 23:57 by angus9576
[精细化工] 招聘 金属平磨液，抛光液研发工程师 +3 小天0311 2026-08-14 3/150 2026-08-16 07:31 by H9PLUS
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭