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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 崩溃了 难题 跪求解答：质粒提不出，酶切切不开
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囧囧俏

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by 半生一梦 at 2012-11-27 19:20:59
是不是你T载体问题啊 我们这边PMD18-T直接买的试剂盒 你要不要重新买个试剂盒儿试试。。。
还有会不会保存菌种的时候哪边操作不当呢 甘油的比例啊神马的。。

我们也是直接购买的试剂盒 也许是带Amp抗性的杂菌
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11楼2012-11-28 10:03:47
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囧囧俏

铁虫 (小有名气)
囧囧俏: 回帖置顶 2012-11-28 10:08:59
请问各位，如果之前的AMP按照1:1000加，后来转变为1:100加，这对保的菌种有什么影响？
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12楼2012-11-28 10:06:18
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zhaodahe

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
10楼: Originally posted by 囧囧俏 at 2012-11-28 10:02:42
划过线，提完了还是特别淡的质粒...

可能是抗生素部分失效了，多放些抗生素呢？我上次也是这样，当时怀疑是抗生素失效了。
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13楼2012-11-28 13:21:16
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小丹木木

荣誉版主 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
引用回帖:
12楼: Originally posted by 囧囧俏 at 2012-11-28 10:06:18
请问各位，如果之前的AMP按照1:1000加，后来转变为1:100加，这对保的菌种有什么影响？

你这是加大了抗生素的浓度啊
关键是你加了AMP后，摇菌长出来了吗？
一般抗生素是看工作浓度的，AMP的工作浓度是100微克/ml,配置成100mg/ml，然后按1:1000的加的啊
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14楼2012-11-28 14:07:07
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囧囧俏

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
14楼: Originally posted by 小丹木木 at 2012-11-28 14:07:07
你这是加大了抗生素的浓度啊
关键是你加了AMP后，摇菌长出来了吗？
一般抗生素是看工作浓度的，AMP的工作浓度是100微克/ml,配置成100mg/ml，然后按1:1000的加的啊...

菌长出来了 但是就是现在这种情况 提不出质粒
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15楼2012-11-28 14:25:08
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zhlf1989513

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
一般提质粒是用摇的新鲜的菌液来提吧。。。楼主直接用质粒酶切然后回收片段如果亮度不是很亮，建议你以提出来的质粒为模板PCR，这样既节省质粒，P出来的条带也很亮，适合于胶回收。。。
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keepon
16楼2012-11-28 14:43:44
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囧囧俏

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
16楼: Originally posted by zhlf1989513 at 2012-11-28 14:43:44
一般提质粒是用摇的新鲜的菌液来提吧。。。楼主直接用质粒酶切然后回收片段如果亮度不是很亮，建议你以提出来的质粒为模板PCR，这样既节省质粒，P出来的条带也很亮，适合于胶回收。。。

谢谢！我基因有两段重复序列中间加一段Linker组成，直接Pcr只能P出一段序列，得不到目的基因。
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17楼2012-11-28 14:54:41
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sxxuan

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
1. 甘油的比例多少？太多了菌株反而不稳定
2. 感受态效率如何？我试过一段时间保存的菌株都失活，虫友们的建议是可能感受态活性低导致的。
3. 摇菌后菌液浓不浓？建议先鉴定一下看看是不是还是你要的那管菌，再提质粒。
4. 不管你的菌里面有没有质粒，加了P2后应该是清亮的，就算菌太多，起码也是比加P1的时候要清一些而且是粘稠的。
5. 如楼上很多虫友提过的，换一管抗生素，加100ul氨苄会导致筛选压力过大，菌长得不一定好的。
6. 切不动的话测序看看pMD18-T上的酶切位点有没有问题，我试过一次有一个项目死活切不下来，一查发现一个酶切位点突变了，特别郁闷，理论上讲T载体没有在紫外下暴露也没有做什么，就是连了个片段而已，就突变了，也不知道是原来就如此还是怎样。分子克隆很神奇的。
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你的日子如何，你的力量也必如何！
18楼2012-11-28 17:03:27
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囧囧俏

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
18楼: Originally posted by sxxuan at 2012-11-28 17:03:27
1. 甘油的比例多少？太多了菌株反而不稳定
2. 感受态效率如何？我试过一段时间保存的菌株都失活，虫友们的建议是可能感受态活性低导致的。
3. 摇菌后菌液浓不浓？建议先鉴定一下看看是不是还是你要的那管菌，再提 ...

是不是我污染了杂菌，如果是，后面转化的也被污染了吗？
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19楼2012-11-29 10:47:19
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囧囧俏

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
18楼: Originally posted by sxxuan at 2012-11-28 17:03:27
1. 甘油的比例多少？太多了菌株反而不稳定
2. 感受态效率如何？我试过一段时间保存的菌株都失活，虫友们的建议是可能感受态活性低导致的。
3. 摇菌后菌液浓不浓？建议先鉴定一下看看是不是还是你要的那管菌，再提 ...

导师让我把三个甘油菌再划线 pcr 然后阳性的再划再pcr 多次克隆后直到挑出阳性菌落，问题是是感染了杂菌吗，这样能挑出来吗？
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20楼2012-11-29 11:10:20
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