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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 崩溃了 难题 跪求解答：质粒提不出，酶切切不开
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sxxuan

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

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囧囧俏: 金币+50, ★有帮助 2012-11-29 16:20:27
引用回帖:
20楼: Originally posted by 囧囧俏 at 2012-11-29 11:10:20
导师让我把三个甘油菌再划线 pcr 然后阳性的再划再pcr 多次克隆后直到挑出阳性菌落，问题是是感染了杂菌吗，这样能挑出来吗？...

划平板是可以分出单菌落的。等有阳性克隆的时候，再提取质粒，鉴定后还可以继续转化。如果只是杂菌，提取质粒的时候质粒相对是比较纯的
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你的日子如何，你的力量也必如何！
21楼2012-11-29 11:23:28
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囧囧俏

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
21楼: Originally posted by sxxuan at 2012-11-29 11:23:28
划平板是可以分出单菌落的。等有阳性克隆的时候，再提取质粒，鉴定后还可以继续转化。如果只是杂菌，提取质粒的时候质粒相对是比较纯的...

如果划线挑出的菌落全为阳性，但是提不出质粒，用该阳性的菌种继续划线吗？
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22楼2012-11-29 17:01:47
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sxxuan

金虫 (著名写手)
你有尝试用新的试剂盒，或者新的溶液，甚至是让你的同学帮忙提一下吗？
因为如果鉴定是阳性，一般不会提不出来的，另外你用的是什么方法提取的？
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你的日子如何，你的力量也必如何！
23楼2012-11-30 15:02:51
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囧囧俏

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
23楼: Originally posted by sxxuan at 2012-11-30 15:02:51
你有尝试用新的试剂盒，或者新的溶液，甚至是让你的同学帮忙提一下吗？
因为如果鉴定是阳性，一般不会提不出来的，另外你用的是什么方法提取的？

用试剂盒 传统方法 同学都试过 提不出来 但是PCR就是阳性
所以才不断划线 尝试
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24楼2012-11-30 15:08:14
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sxxuan

金虫 (著名写手)
你有送测序吗？既然都这样了，不如送测序看看能不能测出你的目的基因，可能不需要测全长，就测一个反应看看。
另外你之前有没有剩下的质粒？稀释过都可以的。测序公司有时候会为客户保存样品一个月的，看看能不能找回送测序那株菌或质粒。
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你的日子如何，你的力量也必如何！
25楼2012-11-30 15:18:21
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囧囧俏

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
25楼: Originally posted by sxxuan at 2012-11-30 15:18:21
你有送测序吗？既然都这样了，不如送测序看看能不能测出你的目的基因，可能不需要测全长，就测一个反应看看。
另外你之前有没有剩下的质粒？稀释过都可以的。测序公司有时候会为客户保存样品一个月的，看看能不能找 ...

之前的送去测序的质粒，转后，PCR阳性，但是切不下来，好奇怪啊
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26楼2012-12-02 16:53:02
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semitaoist

木虫 (著名写手)
我们实验室现在也遇到这种情况了，氨苄抗性的质粒提得很淡，卡纳抗性的质粒没有问题，不知道如何破解。
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27楼2013-05-06 14:04:27
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囧囧俏

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
27楼: Originally posted by semitaoist at 2013-05-06 14:04:27
我们实验室现在也遇到这种情况了，氨苄抗性的质粒提得很淡，卡纳抗性的质粒没有问题，不知道如何破解。

根据我的经验是你的菌污染了，建议划单克或者重新转化质粒
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28楼2013-05-06 14:24:45
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YANJL

银虫 (初入文坛)
请问你最后是怎么解决问题的？我也遇到了相同的问题，加入溶液2后不变澄清，纠结啊
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29楼2015-01-03 18:04:47
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君扬1989

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
10楼: Originally posted by 囧囧俏 at 2012-11-28 10:02:42
划过线，提完了还是特别淡的质粒...

既然能提取出质粒，说明还是有含有目的基因的菌种，如果你摇菌的浓度够了，是不是就只有你菌种被污染的可能，你用的抗生素是氨苄，浓度也挺高了，是不是一些杂菌出现了抗性，要不你就加大菌的浓度试试吧~
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30楼2015-01-03 21:31:20
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