24小时热门版块排行榜

返回列表

当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

囧囧俏

铁虫 (小有名气)

应助: 0 (幼儿园)
金币: 561.9
散金: 46
帖子: 69
在线: 52小时
虫号: 2008396
注册: 2012-09-17
专业: 疫苗学

[求助] 崩溃了难题跪求解答：质粒提不出，酶切切不开

PCR的目的基因1056bp连接到PMD18-T载体上，之后转入TOP10感受态细胞，酶切鉴定并测序合适后，保甘油菌种。
接下来奇怪的事情发生了：1.大概有两个星期的时间，甘油菌种转接后，试剂盒不能提出质粒：加入2液后菌液不变澄清。
2.因为之前可以提出的时候还有剩余的质粒，所以将它转入TOP10感受态细胞，之后可以提出并能酶切下我的目的基因。可是过了两个月，保的菌种质粒越提越淡，现在已经提不出来了。
3.由于提不出质粒，所以在2中转的平板中，有挑选了一些克隆，PCR鉴定OK，提出质粒后，酶切片段特别淡，无法胶回收。

我做了三个不同基因连在T载体，然后都出现了相似的问题，到底是怎么回事呢？连在PMD18-T上的基因不是很稳定吗，该载体也应该很稳定啊，为什么酶切不出基因？之前一直能提出质粒的菌种，为什么都无法提出质粒，有两个菌种能提出质粒，但是酶切后还是特别淡？
一直用的试剂盒提质粒，实验室其它人也在用没有问题，到底问题出在哪了，求神人解答！

回复此楼

» 猜你喜欢

为什么蛋白质氨基酸测定大家都测17种? 已经有5人回复
《灰分记：我与坩埚的“灰烬”之恋》已经有3人回复
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费? 已经有239人回复
求助食品检验工（基础知识），中国劳动社会出版社电子版已经有5人回复
胶体几丁质的结晶度？已经有0人回复
诚挚招收全日制博士！！！中国农业科学院麻类研究所谭志坚研究员课题组招收博士已经有2人回复
三甲基羟乙基丙二胺的合成路线已经有5人回复

» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)

1楼2012-11-27 11:01:59

已阅回复此楼关注TA 给TA发消息送TA红花 TA的回帖

sxxuan

金虫 (著名写手)

MolEPI: 4
应助: 107 (高中生)
金币: 3442.4
散金: 104
红花: 17
帖子: 1478
在线: 266.1小时
虫号: 512865
注册: 2008-02-27
性别: MM
专业: 生物化学

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1

1. 甘油的比例多少？太多了菌株反而不稳定
2. 感受态效率如何？我试过一段时间保存的菌株都失活，虫友们的建议是可能感受态活性低导致的。
3. 摇菌后菌液浓不浓？建议先鉴定一下看看是不是还是你要的那管菌，再提质粒。
4. 不管你的菌里面有没有质粒，加了P2后应该是清亮的，就算菌太多，起码也是比加P1的时候要清一些而且是粘稠的。
5. 如楼上很多虫友提过的，换一管抗生素，加100ul氨苄会导致筛选压力过大，菌长得不一定好的。
6. 切不动的话测序看看pMD18-T上的酶切位点有没有问题，我试过一次有一个项目死活切不下来，一查发现一个酶切位点突变了，特别郁闷，理论上讲T载体没有在紫外下暴露也没有做什么，就是连了个片段而已，就突变了，也不知道是原来就如此还是怎样。分子克隆很神奇的。