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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » pGEM-T载体连接大片段目的基因需要考虑的问题
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065316

金虫 (小有名气)

[求助] pGEM-T载体连接大片段目的基因需要考虑的问题 已有3人参与

想要连接2000-4000大小的目的片段到promega的pGEM-T载体上，感受态是商业化的。目的基因是用TAKARA的primestar HS 扩增得到。之前看到连接大片段比较麻烦，我大概需要注意哪些问题呢，求各位指导，多谢！
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1楼 2014-03-18 09:51:20
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oylb

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065316
11楼2014-03-28 19:38:30
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普通回帖

oylb

禁言 (正式写手)
★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2014-03-18 14:58:10
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2楼2014-03-18 11:18:14
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jjjhhbbb

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
PCR产物多扩增一些，提纯，连接液体积稍微大一些
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3楼2014-03-18 15:19:47
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065316

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by oylb at 2014-03-18 11:18:14
大片段的连接反应，效率会略微低一些，增加连接时间、连接完成后4℃放置一定时间，都可以提高连接效率。应该是可以成功连接的。

primestar HS不能在PCR产物末端加A，所以不能连接到T载体上。必须要在扩增并回收完 ...

一般连接是4℃放置16h以上的。primestar HS PCR过后怎么用普通Taq加末端A？
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4楼2014-03-18 15:41:38
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065316

金虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by jjjhhbbb at 2014-03-18 15:19:47
PCR产物多扩增一些，提纯，连接液体积稍微大一些

连接液不是试剂盒里说的10ul么。5ul的buffer，一般回收产物我会加多点3.5-3.7ul，1ul的连接酶，0.5-0.3ul的载体。
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5楼2014-03-18 15:43:16
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oylb

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6楼2014-03-20 23:38:57
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oylb

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★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
065316: 金币+20, ★★★很有帮助, 非常感谢，试下先。 2014-03-21 11:25:33
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7楼2014-03-20 23:40:26
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065316

金虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by oylb at 2014-03-20 23:38:57
PCR产物纯化，（全部或者部分）作为PCR模板；改用Taq酶，不需要变性，直接72℃延伸10分钟（时间可以调整）；然后再DNA回收，就行了。...

直接添加普通PCR的反应体系，然后只是72℃延伸10min？
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8楼2014-03-21 11:39:25
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oylb

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9楼2014-03-24 10:06:34
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065316

金虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by oylb at 2014-03-24 10:06:34
是的，PCR产物纯化的目的只是为了更换PCR的buffer。72℃延伸10min，基本上差不多了；你要是不放心，30min也行，虽然差别不大。...

我试了一下，网上看到的。14.5ul回收产物+3ul 10*buffer+2ul dNTP+0.5ul Taq酶，混匀后72℃ 20min。跑胶发现条带亮度不是太够。做了两个样，另外一个居然没有了。
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10楼2014-03-27 09:53:45
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