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065316

金虫 (小有名气)

[求助] pGEM-T载体连接大片段目的基因需要考虑的问题已有3人参与

想要连接2000-4000大小的目的片段到promega的pGEM-T载体上,感受态是商业化的。目的基因是用TAKARA的primestar HS 扩增得到。之前看到连接大片段比较麻烦,我大概需要注意哪些问题呢,求各位指导,多谢!
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065316

金虫 (小有名气)

引用回帖:
6楼: Originally posted by oylb at 2014-03-20 23:38:57
PCR产物纯化,(全部或者部分)作为PCR模板;改用Taq酶,不需要变性,直接72℃延伸10分钟(时间可以调整);然后再DNA回收,就行了。...

直接添加普通PCR的反应体系,然后只是72℃延伸10min?
8楼2014-03-21 11:39:25
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oylb

禁言 (正式写手)

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2014-03-18 14:58:10
本帖内容被屏蔽

2楼2014-03-18 11:18:14
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jjjhhbbb

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
PCR产物多扩增一些,提纯,连接液体积稍微大一些
3楼2014-03-18 15:19:47
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065316

金虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by oylb at 2014-03-18 11:18:14
大片段的连接反应,效率会略微低一些,增加连接时间、连接完成后4℃放置一定时间,都可以提高连接效率。应该是可以成功连接的。

primestar HS不能在PCR产物末端加A,所以不能连接到T载体上。必须要在扩增并回收完 ...

一般连接是4℃放置16h以上的。primestar HS PCR过后怎么用普通Taq加末端A?
4楼2014-03-18 15:41:38
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