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065316

金虫 (小有名气)

[求助] pGEM-T载体连接大片段目的基因需要考虑的问题已有3人参与

想要连接2000-4000大小的目的片段到promega的pGEM-T载体上,感受态是商业化的。目的基因是用TAKARA的primestar HS 扩增得到。之前看到连接大片段比较麻烦,我大概需要注意哪些问题呢,求各位指导,多谢!
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065316

金虫 (小有名气)

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2楼: Originally posted by oylb at 2014-03-18 11:18:14
大片段的连接反应,效率会略微低一些,增加连接时间、连接完成后4℃放置一定时间,都可以提高连接效率。应该是可以成功连接的。

primestar HS不能在PCR产物末端加A,所以不能连接到T载体上。必须要在扩增并回收完 ...

一般连接是4℃放置16h以上的。primestar HS PCR过后怎么用普通Taq加末端A?
4楼2014-03-18 15:41:38
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065316

金虫 (小有名气)

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3楼: Originally posted by jjjhhbbb at 2014-03-18 15:19:47
PCR产物多扩增一些,提纯,连接液体积稍微大一些

连接液不是试剂盒里说的10ul么。5ul的buffer,一般回收产物我会加多点3.5-3.7ul,1ul的连接酶,0.5-0.3ul的载体。
5楼2014-03-18 15:43:16
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065316

金虫 (小有名气)

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6楼: Originally posted by oylb at 2014-03-20 23:38:57
PCR产物纯化,(全部或者部分)作为PCR模板;改用Taq酶,不需要变性,直接72℃延伸10分钟(时间可以调整);然后再DNA回收,就行了。...

直接添加普通PCR的反应体系,然后只是72℃延伸10min?
8楼2014-03-21 11:39:25
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065316

金虫 (小有名气)

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9楼: Originally posted by oylb at 2014-03-24 10:06:34
是的,PCR产物纯化的目的只是为了更换PCR的buffer。72℃延伸10min,基本上差不多了;你要是不放心,30min也行,虽然差别不大。...

我试了一下,网上看到的。14.5ul回收产物+3ul 10*buffer+2ul dNTP+0.5ul Taq酶,混匀后72℃ 20min。跑胶发现条带亮度不是太够。做了两个样,另外一个居然没有了。
10楼2014-03-27 09:53:45
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065316

金虫 (小有名气)

送红花一朵
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11楼: Originally posted by oylb at 2014-03-28 19:38:30
不会吧?PCR完了之后DNA都没有了?不可思议,那应该是其他环节问题。“14.5ul回收产物+3ul 10*buffer+2ul dNTP+0.5ul Taq酶”,为什么是3ul 而不是2ul buffer呢?不过这也不会导致DNA消失……

条带亮度不够?还是 ...

那应该是2ul 10*buffer+3ul dNTP?还看到一种做法是巢式PCR 30个循环之后拿出来直接加0.5ul的taq酶延伸10min,这也可以吧。
亮度可能是我之前回收的时候浓度就不大吧。
12楼2014-03-28 22:38:20
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