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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » pGEM-T载体连接大片段目的基因需要考虑的问题
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065316

金虫 (小有名气)

[求助] pGEM-T载体连接大片段目的基因需要考虑的问题 已有3人参与

想要连接2000-4000大小的目的片段到promega的pGEM-T载体上，感受态是商业化的。目的基因是用TAKARA的primestar HS 扩增得到。之前看到连接大片段比较麻烦，我大概需要注意哪些问题呢，求各位指导，多谢！
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1楼 2014-03-18 09:51:20
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jjjhhbbb

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
PCR产物多扩增一些，提纯，连接液体积稍微大一些
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3楼2014-03-18 15:19:47
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oylb

禁言 (正式写手)
★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2014-03-18 14:58:10
本帖内容被屏蔽
2楼2014-03-18 11:18:14
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065316

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by oylb at 2014-03-18 11:18:14
大片段的连接反应，效率会略微低一些，增加连接时间、连接完成后4℃放置一定时间，都可以提高连接效率。应该是可以成功连接的。

primestar HS不能在PCR产物末端加A，所以不能连接到T载体上。必须要在扩增并回收完 ...

一般连接是4℃放置16h以上的。primestar HS PCR过后怎么用普通Taq加末端A？
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4楼2014-03-18 15:41:38
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065316

金虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by jjjhhbbb at 2014-03-18 15:19:47
PCR产物多扩增一些，提纯，连接液体积稍微大一些

连接液不是试剂盒里说的10ul么。5ul的buffer，一般回收产物我会加多点3.5-3.7ul，1ul的连接酶，0.5-0.3ul的载体。
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5楼2014-03-18 15:43:16
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