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fanwq258

木虫 (正式写手)

[交流] T载体连接不上去

自己扩增的基因，连接T载体就是连不上，但是买载体时带的插入片段可以连接上，这可该怎么办呢？
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1楼 2013-08-05 09:53:35
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flyhigh805

金虫 (初入文坛)
★ ★ ★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
amisking: 金币+5, 感谢发帖应助，帮助虫子 2013-08-05 18:28:46
amisking: 回帖置顶 2013-08-05 18:28:48
你的目的片段大小是多少啊，太大的话连T载可能有点困难，但是只要优化连接条件连上去应该很容易的。应尝试提高PCR产物的浓度，可以取少量PCR产物电泳检测如果大小正确的话剩下的PCR产物直接过胶回收的柱子，这样得到的PCR产物浓度高，另外增加连接时间16℃过夜或4℃过夜。
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5楼2013-08-05 17:16:03
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
你是什么酶扩出来的片段，如果是高保真酶的话，你考虑加A尾了吗？
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2楼2013-08-05 13:35:34
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yuminzorro

木虫 (小有名气)
★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-08-10 14:19:36
你的pcr产物特异性如何，如果没有非特异性条带的话，不要纯化直接连接，我2周前遇到和你类似的情况，不纯话直接连就没问题，我用的是全日金的T1载体，4ul产物+1ul载体。你可以试试看，希望对你有帮助哦！
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17楼2013-08-09 22:45:32
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普通回帖

fanwq258

木虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by gyesang at 2013-08-05 13:35:34
你是什么酶扩出来的片段，如果是高保真酶的话，你考虑加A尾了吗？

不是高保真的酶，用的就是宝生物普通的ex taq
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3楼2013-08-05 14:51:24
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hyphen007

金虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
考虑下连接条件、片段大小及各种成分的量
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4楼2013-08-05 15:24:40
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fanwq258

木虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by flyhigh805 at 2013-08-05 17:16:03
你的目的片段大小是多少啊，太大的话连T载可能有点困难，但是只要优化连接条件连上去应该很容易的。应尝试提高PCR产物的浓度，可以取少量PCR产物电泳检测如果大小正确的话剩下的PCR产物直接过胶回收的柱子，这样得到 ...

我的目的片段也就是800多，浓度在25ng/UL左右，买载体是带的片段也就700多bp，浓度是50ng/UL，我就是按照自带片段的浓度加的，可是就是连接不上
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6楼2013-08-05 18:43:10
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wswsjz

木虫 (职业作家)
祝福，祝福，顶起来，抢顶楼！
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7楼2013-08-05 19:00:09
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123n

木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
用的什么T载体？建议调整一下片段的浓度。。
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8楼2013-08-05 21:48:28
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追梦草

新虫 (初入文坛)
★ ★ ★
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fanwq258(gyesang代发): 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-08-08 10:30:49
浓度再提高些，16度再多连会，会更有可能连上。我前一阵刚连上3900bp的片段，PCR产物胶回收柱浓度为400ng/ul，16度连了14h.
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9楼2013-08-05 23:02:13
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duoyidian

木虫 (正式写手)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
fanwq258(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-08-08 10:30:57
一般是反应的时间不够，链接的条件的一般不会差多少的
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10楼2013-08-06 13:54:48
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joan198108

铁杆木虫 (正式写手)
★
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-08-08 10:31:02
调整比例，延长链接时间，考虑采用solution 1链接一下试试
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11楼2013-08-06 15:25:18
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54808455

新虫 (初入文坛)
★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-08-08 09:57:42
QIAGEN公司的研发专家发现，PCR引物5’端的碱基（也就是引物第一个碱基）的不同，会影响PCR产物的连接效率！检查下你的引物。
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  • 附件 1 : IncreasingefficiencyofcloningPCRproducts.pdf
    • 2013-08-07 18:28:12, 67.27 K
13楼2013-08-07 18:28:22
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yuguiyan

至尊木虫 (文坛精英)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-08-08 09:57:50
真的假的啊？你连了几次失败啊？不就是DNA纯化产物4微，T-VECTOR 1微，solution 1   1微嘛！So easy!
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14楼2013-08-07 21:42:22
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lqbzfun

铜虫 (初入文坛)
★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
gyesang: 金币+3, 鼓励回帖应助！ 2013-08-08 10:30:39
赶紧去丁香园的试用中心申请个无缝克隆的试剂盒
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15楼2013-08-07 22:15:19
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cookee1981

银虫 (初入文坛)
★
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估计是没有带A尾
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16楼2013-08-08 10:43:32
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flyhigh805

金虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
6楼: Originally posted by fanwq258 at 2013-08-05 18:43:10
我的目的片段也就是800多，浓度在25ng/UL左右，买载体是带的片段也就700多bp，浓度是50ng/UL，我就是按照自带片段的浓度加的，可是就是连接不上...

建议按照我上面所说的方法提高目的片段的浓度
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18楼2013-08-10 17:03:35
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zhaihong1983

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
连不上是什么意思？是没有菌落长出来还是，有单菌落，但是鉴定后发现不是？
如果是没有菌落，那你的PCR产物是什么酶P出来的，如果是高保真酶，你的PCR产物加T处理了吗？没加T肯定连不上。
如果有很多菌落，但是鉴定后不是，那你的PCR产物是做的胶回收吗？如果没做胶回收直接连的话，很容易连上的都是引物二聚体。
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19楼2013-08-16 13:18:23
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lifajun1976

木虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
把PCR的产物浓度做大点，就没问题
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20楼2013-08-16 15:30:04
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xingjiuwcc

木虫 (著名写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
PCR最后一步72℃7分钟有吗，没有就不行了。。。。
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21楼2013-08-16 18:00:57
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lijia2054224

金虫 (初入文坛)
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
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fanwq258: 金币+7 2013-08-22 15:36:24
现在已经做出来了吧，哈哈，你那么聪明
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22楼2013-08-22 15:33:43
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随缘棒棒糖

新虫 (初入文坛)
★
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引用回帖:
9楼: Originally posted by 追梦草 at 2013-08-05 23:02:13
浓度再提高些，16度再多连会，会更有可能连上。我前一阵刚连上3900bp的片段，PCR产物胶回收柱浓度为400ng/ul，16度连了14h.

想请问您一下您的连接比例，我的目的片段3000-3500之间，连接做了一个月，没有结果。各种体系，比例，连接时间都尝试了，依然没成功。请不吝指教。
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23楼2013-08-23 11:28:51
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追梦草

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
23楼: Originally posted by 随缘棒棒糖 at 2013-08-23 11:28:51
想请问您一下您的连接比例，我的目的片段3000-3500之间，连接做了一个月，没有结果。各种体系，比例，连接时间都尝试了，依然没成功。请不吝指教。...

我也是连了好几次才连上的。。。没有计算连接比例，我觉得尽量提高PCR产物回收的浓度和16度连接时间，连上的可能性会变大。还有转化最好做对照，保证感受态细胞，水浴锅的温度等都没问题，我们水浴锅的温度与我用温度计测的差3度…我感觉连长片段还要靠点运气，祝你好运。
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24楼2013-08-24 11:37:51
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93wbj

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
9楼: Originally posted by 追梦草 at 2013-08-05 23:02:13
浓度再提高些，16度再多连会，会更有可能连上。我前一阵刚连上3900bp的片段，PCR产物胶回收柱浓度为400ng/ul，16度连了14h.

请问你用的胶回收试剂盒是哪家的啊。我的胶回收序列太低了。
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25楼2016-05-19 18:33:09
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何何y

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
17楼: Originally posted by yuminzorro at 2013-08-09 22:45:32
你的pcr产物特异性如何，如果没有非特异性条带的话，不要纯化直接连接，我2周前遇到和你类似的情况，不纯话直接连就没问题，我用的是全日金的T1载体，4ul产物+1ul载体。你可以试试看，希望对你有帮助哦！

你好，我也在用全式金的载体，目标片段3000多，怎么也连不上。不知道什么原因
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26楼2017-12-14 11:55:41
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小熊长大了

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
26楼: Originally posted by 何何y at 2017-12-14 11:55:41
你好，我也在用全式金的载体，目标片段3000多，怎么也连不上。不知道什么原因...

您好，请问您TA克隆做出来了吗？从年前做到现在一直没出来
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27楼2018-03-09 14:57:02
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piaofu12楼
2013-08-06 15:58   回复  
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