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630384464

新虫 (初入文坛)

[求助] PMD19-T载体连接不上428bp的片段

使用TAKARA的PMD19-T载体，连接428bp大小的片段。用的感受态是DH5α。体系是solution1   5微升，19-T  1微升，片段浓度16ng/ul，用4ul。反应时间是16℃下2小时。片段是KOD酶扩出来的，切胶回收后又用Tag酶加A，再切胶回收后用于连接的。 感受态活力良好，为什么涂板之后菌落特别少，就算有也是蓝斑多。挑过几个白斑，用M13引物扩，显示没有连上。为什么啊？
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1楼 2012-04-17 09:52:09
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

honinglee

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜: 金币+3, 鼓励交流！技术在进步，咱不能老抱着旧东西，呵呵~ 2012-04-17 19:26:49
对还纠结于T-载连接这种小问题的童鞋我深表同情，曾经的我浪费了大量的时间在载体构建上，现在想想这些逝去的时间都痛心，几年过去了，现在好多带致死基因的PCR克隆载体十分好用，别再用那些蓝白筛选的载体了，耗时费力。用个好点的酶，推荐FERMENTAS的，3000KB以下不用测序的，用个带致死基因的载体（许多选择，英骏的，FERMENTAS的，全式金的，多的很，一般都不是太贵），15分钟室温连接后直接转化，一般会长出十来个菌落，基本都是阳性克隆。挑菌直接下一步实验即可，会省不少时间的。强烈建议！需要具体货号站内直接PM我。

希望采纳，别在载体构建上耗费太多时间。
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天下事有难易乎？为之，则难者亦易矣；不为，则易者亦难矣。
10楼2012-04-17 16:58:40
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普通回帖

zhaohq1209

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 谢谢斑斑的支持 2012-04-17 13:45:39
片段浓度太低。
为什么不用直接加A的聚合酶试试？
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我有一个梦想，我梦想有一天，我们的人民可以根据自己的意愿与消费能力，居住在自己愿意居住的地方。
2楼2012-04-17 09:59:31
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630384464

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by zhaohq1209 at 2012-04-17 09:59:31:
片段浓度太低。
为什么不用直接加A的聚合酶试试？

能说个具体的酶么？
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3楼2012-04-17 10:32:11
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adloves

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
可能你的片段没加上A尾吧，试试直接用Taq酶扩增吧，我最近做了一片段2722bp，直接连上了~
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杜钰~
4楼2012-04-17 10:36:40
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630384464

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by adloves at 2012-04-17 10:36:40:
可能你的片段没加上A尾吧，试试直接用Taq酶扩增吧，我最近做了一片段2722bp，直接连上了~

试过了。Taq酶扩不出来。。。。。。
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5楼2012-04-17 11:03:20
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adloves

新虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 630384464 at 2012-04-17 11:03:20:
试过了。Taq酶扩不出来。。。。。。

Taq扩增不出来目的片段嘛？ 这个怎么会，那体系和条件摸索过没有？
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杜钰~
6楼2012-04-17 11:23:12
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630384464

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by adloves at 2012-04-17 11:23:12:
Taq扩增不出来目的片段嘛？ 这个怎么会，那体系和条件摸索过没有？

体系20ul。。。退火温度也拉过梯度。。就是扩不出来。还要摸索什么条件？
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7楼2012-04-17 12:05:38
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xieweifa

禁虫 (初入文坛)
感谢参与，应助指数 +1
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8楼2012-04-17 15:05:40
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630384464

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by xieweifa at 2012-04-17 15:05:40:
从来没有遇到过你这种情况，taq酶如果扩不出来的话，那可能就是你的引物不好，建议重新设计引物试试。

引物方面的话应该没有大问题。之前都用KOD酶扩的，内引物扩增产物只有单一目的亮带。
改成Taq酶，探索了体系还有退火温度。都不管用。哎。。。。
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9楼2012-04-17 15:13:05
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