应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » PMD19-T载体连接不上428bp的片段
北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
211/3返回列表123下一页
查看: 3459  |  回复: 20
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

630384464

新虫 (初入文坛)

[求助] PMD19-T载体连接不上428bp的片段

使用TAKARA的PMD19-T载体，连接428bp大小的片段。用的感受态是DH5α。体系是solution1   5微升，19-T  1微升，片段浓度16ng/ul，用4ul。反应时间是16℃下2小时。片段是KOD酶扩出来的，切胶回收后又用Tag酶加A，再切胶回收后用于连接的。 感受态活力良好，为什么涂板之后菌落特别少，就算有也是蓝斑多。挑过几个白斑，用M13引物扩，显示没有连上。为什么啊？
回复此楼

» 收录本帖的淘帖专辑推荐

分子生物学资料 分子生物实验相关

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2012-04-17 09:52:09
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

honinglee

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜: 金币+3, 鼓励交流！技术在进步，咱不能老抱着旧东西，呵呵~ 2012-04-17 19:26:49
对还纠结于T-载连接这种小问题的童鞋我深表同情，曾经的我浪费了大量的时间在载体构建上，现在想想这些逝去的时间都痛心，几年过去了，现在好多带致死基因的PCR克隆载体十分好用，别再用那些蓝白筛选的载体了，耗时费力。用个好点的酶，推荐FERMENTAS的，3000KB以下不用测序的，用个带致死基因的载体（许多选择，英骏的，FERMENTAS的，全式金的，多的很，一般都不是太贵），15分钟室温连接后直接转化，一般会长出十来个菌落，基本都是阳性克隆。挑菌直接下一步实验即可，会省不少时间的。强烈建议！需要具体货号站内直接PM我。

希望采纳，别在载体构建上耗费太多时间。
赞一下(2人) 回复此楼
天下事有难易乎？为之，则难者亦易矣；不为，则易者亦难矣。
10楼2012-04-17 16:58:40
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通回帖

zhaohq1209

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 谢谢斑斑的支持 2012-04-17 13:45:39
片段浓度太低。
为什么不用直接加A的聚合酶试试？
赞一下 回复此楼
我有一个梦想，我梦想有一天，我们的人民可以根据自己的意愿与消费能力，居住在自己愿意居住的地方。
2楼2012-04-17 09:59:31
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

630384464

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by zhaohq1209 at 2012-04-17 09:59:31:
片段浓度太低。
为什么不用直接加A的聚合酶试试？

能说个具体的酶么？
赞一下 回复此楼
3楼2012-04-17 10:32:11
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

adloves

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
可能你的片段没加上A尾吧，试试直接用Taq酶扩增吧，我最近做了一片段2722bp，直接连上了~
赞一下 回复此楼
杜钰~
4楼2012-04-17 10:36:40
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

630384464

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by adloves at 2012-04-17 10:36:40:
可能你的片段没加上A尾吧，试试直接用Taq酶扩增吧，我最近做了一片段2722bp，直接连上了~

试过了。Taq酶扩不出来。。。。。。
赞一下 回复此楼
5楼2012-04-17 11:03:20
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

adloves

新虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 630384464 at 2012-04-17 11:03:20:
试过了。Taq酶扩不出来。。。。。。

Taq扩增不出来目的片段嘛？ 这个怎么会，那体系和条件摸索过没有？
赞一下 回复此楼
杜钰~
6楼2012-04-17 11:23:12
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

630384464

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by adloves at 2012-04-17 11:23:12:
Taq扩增不出来目的片段嘛？ 这个怎么会，那体系和条件摸索过没有？

体系20ul。。。退火温度也拉过梯度。。就是扩不出来。还要摸索什么条件？
赞一下 回复此楼
7楼2012-04-17 12:05:38
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

xieweifa

禁虫 (初入文坛)
感谢参与，应助指数 +1
本帖内容被屏蔽
8楼2012-04-17 15:05:40
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

630384464

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by xieweifa at 2012-04-17 15:05:40:
从来没有遇到过你这种情况，taq酶如果扩不出来的话，那可能就是你的引物不好，建议重新设计引物试试。

引物方面的话应该没有大问题。之前都用KOD酶扩的，内引物扩增产物只有单一目的亮带。
改成Taq酶，探索了体系还有退火温度。都不管用。哎。。。。
赞一下 回复此楼
9楼2012-04-17 15:13:05
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 630384464 的主题更新
211/3返回列表123下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 复试调剂 +4 asdasdassda 2026-04-05 4/200 2026-04-06 07:01 by houyaoxu
[考研] 284求调剂 +7 徐同学_001 2026-04-04 13/650 2026-04-05 17:19 by yulian1987
[考研] 275求调剂 +16 waltzh 2026-04-01 16/800 2026-04-05 17:14 by Hdyxbekcb
[考研] 材料调剂 +12 一样YWY 2026-04-04 12/600 2026-04-05 08:24 by 544594351
[考研] 一志愿安徽某211 0703化学总分339求调剂 +6 晚风不晚 2026-04-04 6/300 2026-04-04 20:11 by dongzh2009
[考研] 0835学硕299求调剂 08大类可接受 +5 useryy 2026-04-03 5/250 2026-04-04 20:07 by 蓝云思雨
[考研] 321求调剂 +13 认真求上学 2026-04-02 13/650 2026-04-04 18:23 by macy2011
[考研] 一志愿0817化学工程与技术，求调剂 +24 我不是只因 2026-04-02 28/1400 2026-04-04 15:15 by dongzh2009
[考研] 22408，264求调剂 +3 ywh729 2026-04-03 4/200 2026-04-04 11:04 by ywh729
[考研] 282求调剂 +20 ycy1201 2026-04-01 22/1100 2026-04-04 00:42 by userper
[考研] 总分328生物与医药考数学求调剂 +7 aaadim 2026-04-02 9/450 2026-04-03 22:53 by syh9288
[考研] 350一志愿北京航空航天大学08500材料科学与工程求调剂 +5 kjnasfss 2026-04-03 5/250 2026-04-03 22:29 by 无际的草原
[考研] 一志愿华中农业071010，总分320求调剂 +7 困困困困坤坤 2026-04-02 7/350 2026-04-03 17:26 by Yuena_Wang
[考研] 316求调剂 +14 舟自梗 2026-04-01 18/900 2026-04-03 10:28 by linyelide
[考研] 材料考研调剂 +10 Gs大王 2026-04-02 10/500 2026-04-03 09:47 by 遗忘消失的灆
[考研] 环境工程297分求调剂一志愿杭高院 +15 GENJIOW 2026-03-31 16/800 2026-04-02 17:56 by cyh—315
[考研] 318求调剂 +3 笃行致远. 2026-03-31 4/200 2026-04-02 15:56 by Jaylen.
[考研] 283求调剂 +3 jiouuu 2026-04-02 4/200 2026-04-02 14:08 by 哒哒哒呱呱呱
[考研] 一志愿 南京航空航天大学 ，080500材料科学与工程学硕 +10 @taotao 2026-03-31 11/550 2026-04-01 09:43 by xiayizhi
[考研] 274求调剂 +6 xiao爱同学 2026-03-30 6/300 2026-03-31 10:04 by cal0306
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭