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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » PMD19-T载体连接不上428bp的片段
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630384464

新虫 (初入文坛)

[求助] PMD19-T载体连接不上428bp的片段

使用TAKARA的PMD19-T载体，连接428bp大小的片段。用的感受态是DH5α。体系是solution1   5微升，19-T  1微升，片段浓度16ng/ul，用4ul。反应时间是16℃下2小时。片段是KOD酶扩出来的，切胶回收后又用Tag酶加A，再切胶回收后用于连接的。 感受态活力良好，为什么涂板之后菌落特别少，就算有也是蓝斑多。挑过几个白斑，用M13引物扩，显示没有连上。为什么啊？
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1楼 2012-04-17 09:52:09
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630384464

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by xieweifa at 2012-04-17 15:05:40:
从来没有遇到过你这种情况，taq酶如果扩不出来的话，那可能就是你的引物不好，建议重新设计引物试试。

引物方面的话应该没有大问题。之前都用KOD酶扩的，内引物扩增产物只有单一目的亮带。
改成Taq酶，探索了体系还有退火温度。都不管用。哎。。。。
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9楼2012-04-17 15:13:05
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zhaohq1209

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 谢谢斑斑的支持 2012-04-17 13:45:39
片段浓度太低。
为什么不用直接加A的聚合酶试试？
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我有一个梦想，我梦想有一天，我们的人民可以根据自己的意愿与消费能力，居住在自己愿意居住的地方。
2楼2012-04-17 09:59:31
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630384464

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by zhaohq1209 at 2012-04-17 09:59:31:
片段浓度太低。
为什么不用直接加A的聚合酶试试？

能说个具体的酶么？
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3楼2012-04-17 10:32:11
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adloves

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
可能你的片段没加上A尾吧，试试直接用Taq酶扩增吧，我最近做了一片段2722bp，直接连上了~
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杜钰~
4楼2012-04-17 10:36:40
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