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630384464

新虫 (初入文坛)

[求助] PMD19-T载体连接不上428bp的片段

使用TAKARA的PMD19-T载体,连接428bp大小的片段。用的感受态是DH5α。体系是solution1   5微升,19-T  1微升,片段浓度16ng/ul,用4ul。反应时间是16℃下2小时。片段是KOD酶扩出来的,切胶回收后又用Tag酶加A,再切胶回收后用于连接的。 感受态活力良好,为什么涂板之后菌落特别少,就算有也是蓝斑多。挑过几个白斑,用M13引物扩,显示没有连上。为什么啊?
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adloves

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
可能你的片段没加上A尾吧,试试直接用Taq酶扩增吧,我最近做了一片段2722bp,直接连上了~
杜钰~
4楼2012-04-17 10:36:40
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zhaohq1209

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 谢谢斑斑的支持 2012-04-17 13:45:39
片段浓度太低。
为什么不用直接加A的聚合酶试试?
我有一个梦想,我梦想有一天,我们的人民可以根据自己的意愿与消费能力,居住在自己愿意居住的地方。
2楼2012-04-17 09:59:31
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630384464

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by zhaohq1209 at 2012-04-17 09:59:31:
片段浓度太低。
为什么不用直接加A的聚合酶试试?

能说个具体的酶么?
3楼2012-04-17 10:32:11
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630384464

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
4楼: Originally posted by adloves at 2012-04-17 10:36:40:
可能你的片段没加上A尾吧,试试直接用Taq酶扩增吧,我最近做了一片段2722bp,直接连上了~

试过了。Taq酶扩不出来。。。。。。
5楼2012-04-17 11:03:20
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